《微生物-矿物相互作用表征及分子模拟》针对微生物-矿物相互作用，兼顾其微观作用过程和宏观效应，介绍其作用原理、研究策略与技术、表征及分子模拟。主要方法和技术包括基于同步辐射的高分辨率光谱学和显微化学成像等（原位）分析技术、基于实验室的常规光谱学和显微镜检等表面分析技术、DFT计算及比较蛋白质组学/基因组学技术。主要内容涉及矿物/微生物表面微结构与化学形态演化、微生物群落结构与功能演替、硫化矿物选择性生物吸附分子模拟、微生物吸附行为、生物膜形成与演化、EPS组成与性质、硫代谢相关蛋白质筛选与功能分析。

第1章 微生物–矿物相互作用的基本原理
微生物–矿物相互作用是指微生物通过氧化还原、酸碱、络合等作用，导致矿物的溶解、转化和沉淀，同时获得能源和营养元素以供其自身生长或繁殖的过程，受矿物种类、形态、表面性质及微生物种群结构与功能等的重要影响。微生物–矿物相互作用是地球表生环境下重要的地质作用类型，驱动着微生物与矿物的共同进化，对生命演化（包括小分子有机质合成与转化、化能/光能自养–兼养/异养进化等）、地球表层系统演化（包括生物矿化、岩石的风化及矿物膜的形成等）、元素的地球化学循环等产生重要影响（董海良，2013；谢树成 等，2011；Gadd，2010；刘丛强，2007）。
1.1 微生物–矿物相互作用的宏观效应
微生物虽然个体微小，但数量巨大、变异性强、生态和代谢类型多样，广泛分布于地表环境（连宾，2014）。微生物–矿物相互作用贯穿于地球生命的演化史。数十亿年以来，不同形式的生命活动不断影响地球表层物质循环与环境演化，无机界物质循环与演化又制约着地球生态系统的演替（鲁安怀 等，2013）。微生物–矿物相互作用发生在微观尺度，但产生的效应往往是宏观的，如酸性矿山废水的形成、岩石矿物的风化和腐蚀、矿物元素的地球化学循环、矿物生物浸出和矿山环境修复等。
1.1.1 微生物参与酸性矿坑水的形成
酸性矿山废水（acid mine drainage，AMD）（图1.1），通常指的是废矿和尾矿的酸性浸出水，含有高浓度硫酸盐和有毒重金属离子。AMD尽管是一种高酸性、热的**环境，但是其中仍然存在很多微生物，这些微生物在矿石的亚表层能够形成一个化能自养的生态系统，通过从金属硫化矿物中获得电子供体，从空气中获得二氧化碳（CO2）、氧气（O2）和氮气（N2），以及水与岩石相互作用释放的磷酸盐来维持生长和繁殖。这些微生物的生长与代谢过程促进AMD的形成，是AMD大量形成的重要原因。根据微生物生长pH的不同，可以将微生物分为耐酸微生物、嗜酸微生物和**嗜酸微生物。AMD中的嗜酸微生物协同作用，加速矿石的分解和重金属的释放，造成巨大的环境污染（戴志敏，2007；Baker et al.，2003）。
图1.1 大量排放和累积的酸性矿坑水（大宝山）
1.1.2 微生物引起岩石矿物的风化和腐蚀
1. 岩石矿物的生物风化
生物风化是指矿物、岩石受生物生长及活动影响而发生的风化作用（陆现彩 等，2011；李莎 等，2006）。一方面，生物通过生命活动的黏着、穿插和剥离等机械活动使矿物颗粒分解被认为是生物物理风化作用，如树根生长对岩石的压力能使根深入岩石裂缝，劈开岩石。苔藓和地衣（内含蓝细菌及藻类）在贫瘠的岩石表面生长，形成一个更为潮湿的化学微环境，加速岩石的生物化学风化（Lian et al.，2008）。另一方面，��物通过自身分泌及死后遗体析出的酸性物质如有机酸、硝酸、碳酸、亚硝酸等也可以使岩石分解（Chizhikova et al.，2016）。微生物的生物化学风化作用对岩石所产生的总分解力远远超过全部动植物所具有的总分解力，是土壤形成的重要驱动力（Gadd，2007）。
2. 微生物参与矿物的腐蚀
微生物细胞通过新陈代谢的中间产物和/或*终产物及胞外酶等参与矿物材料的腐蚀，腐蚀的本质是一种化学过程（Gu，2012；Rockyde et al.，2008）。根据是否需氧可将微生物腐蚀分为厌氧腐蚀和好氧腐蚀，实际上在生物膜中，不同的菌种共生在一起，对矿物发生厌氧腐蚀的同时也发生好氧腐蚀。参与生物腐蚀的微生物主要有：硫酸盐还原菌、硫氧化菌、腐生菌、铁细菌和真菌等。在这些腐蚀过程中，在材料或管道表面所形成的次生矿物，通过原电池效应大大加速微生物的腐蚀过程（Huber et al.，2014；Wei et al.，2010）。
1.1.3 微生物参与矿物的形成
微生物参与的生物矿化作用可分为生物诱导矿化（biologically induced mineralization）和生物控制矿化（biologically controlled mineralization）（Tourney et al.，2014；Li et al.，2013），生物矿化与非生物矿化作用明显不同的是无机相的结晶严格受生物分泌的有机质的控制。生物诱导矿化作用基本上是由细胞表面充当异质成核位点而引起的矿化作用，受环境条件的影响形成尺寸大小和形态各异的矿物颗粒。生物诱导矿化作用在原核生物的藻类和真菌中存在较多。生物控制矿化是指矿物的成核、生长、沉积、成矿和矿物形貌受到微生物基因表达的控制，矿物通常在生物细胞内的有机基质或囊泡内沉淀结晶，形成晶型规则、粒度均一、排布整齐、分布有序的矿物集合体。硅藻土、贝壳珍珠层和颗石藻等的形成在很大程度上是生物控制矿化的结果（史家远 等，2011；王宗霞 等，2006；Paasche，2001），如图1.2所示。
（a）硅藻土（王宗霞 等，2006） （b）颗石藻（Paasche，2001）
图1.2 生物成矿
在一定的环境条件下，微生物通过生命代谢活动对成矿物质的捕获和沉积作用逐渐产生大量有机–无机共生结构，并*终形成生物矿物或微生物岩，包括硅酸盐矿物、碳酸盐矿物、磷酸盐矿物、硫酸盐矿物、氧化物和氢氧化物等。生物成因碳酸盐矿物是分布*广泛和*丰富的矿物，例如微晶石、文石和前寒武纪时期大规模叠层石等的形成都与微生物的存在密切相关（周根陶 等，2018；谢先德 等，2001）。
1.1.4 微生物参与矿物元素的地球化学循环
微生物–矿物相互作用广泛参与元素的地球化学循环，包括组成生命物质的大量元素（C、H、O、N、P、S、K、Ca、Mg等）和微量元素（Fe、Al、B、Co、Cr、Cu、Mo、Ni、Se、V、Zn、卤族元素等），以及环境中的重金属元素和放射性元素等，其中Fe/S氧化还原相关的Fe/S循环是地表环境元素地球化学循环*重要的驱动力。硫（S）元素在自然界中存在多种价态（.2、.1、0、+2、+4、+5、+6），构成多种类型的化合物和含硫矿物，环境中的硫既可作为电子供体也可作为电子受体参与微生物硫氧化、硫还原和硫歧化作用等能量代谢过程。硫氧化微生物氧化单质硫和还原性硫化合物形成硫酸盐，硫酸盐作为电子受体在厌氧环境中被硫酸盐还原菌还原成S2.，S2.进一步作为电子供体被硫氧化微生物氧化，同时硫元素被微生物同化吸收作为半胱氨酸（cysteine，Cys）和蛋氨酸及辅酶A等维生素的组成部分形成有机硫（Siciliano et al.，2005）。参与硫循环的微生物多种多样，包括好氧型古生菌、好氧型化能自养细菌和厌氧型光合硫细菌等（万云洋 等，2017）。在厌氧条件下，硫酸盐还原菌和元素硫还原菌耦合可使自然界中Fe(III)化合物/矿物还原，形成FeS型矿物，对重金属具有极强的吸附活性（Flynn et al.，2014）。埋地管线/船舶表面的微生物厌氧硫酸盐还原产生次生矿物并形成原电池，促进铁基材料的快速腐蚀（Hendrik et al.，2013）。微生物铁硫氧化还原耦合可有效驱动砷形态的转化和迁移（Huang，2014）。
1.1.5 矿物的生物浮选
微生物–矿物相互作用过程中微生物细胞逐渐吸附在矿物表面，一方面细胞受到矿物的影响，其理化性质发生改变，另一方面细胞对矿物的表面修饰作用导致矿物的物理化学
性质的改变。利用微生物定向改变矿物表面性质的能力，微生物可充当絮凝剂、浮选捕收剂或浮选调整剂等达到对矿物沉淀或浮选分离的目的。例如对煤炭的生物浮选，典型的微生物包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、多黏芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）、嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）、草分枝杆菌（Mycobacterium phlei）等，作为捕收剂，在对煤的处理和表面改性过程中达到脱硫和降低灰分的作用（贾春云，2010）。
1.1.6 矿山环境的微生物修复
AMD环境含有大量有毒有害重金属离子，利用微生物去除重金属离子可以对AMD进行环境修复。微生物细胞表面含有大量的功能基团如羧基、羟基、磷酰基等，这些基团通过与金属离子的离子交换或/和络合作用对金属离子进行吸附和固定。此外，重金属离子还能在细胞壁上或细胞内形成无机沉淀物，它们以磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐或氢氧化物等形式通过结晶作用在细胞壁上或细胞内沉淀（陈勇生 等，1997）。硫酸盐还原菌在厌氧呼吸过程中以硫酸根离子作为电子受体，将其还原并产生H2S，可将大量AMD中的金属离子沉淀，显著降低AMD的危害。
1.2 微生物-矿物相互作用的类型
自然界矿物的类型包括单质、硫化矿、氧化矿、含氧盐及卤化物矿，其中金属硫化矿和金属氧化矿是两种主要的矿物类型，也是矿山开采的主要对象。根据金属硫化矿和金属氧化矿两种主要矿物类型，微生物-矿物相互作用的类型可分为微生物-（类）金属硫化矿相互作用和微生物-（类）金属氧化矿相互作用。前者是一类嗜酸化能自养微生物对矿物的铁硫氧化作用（图1.3），硫化矿被Fe3+氧化释放金属离子的同时生成单质硫和Fe2+，嗜酸性铁/硫氧化微生物将Fe2+和单质硫氧化生成Fe3+和硫酸，持续性地氧化溶解硫化矿。自然界中AMD的形成和工业上低品位矿物资源的生物浸出属于这种类型。后者是一类异养微生物对矿物酸碱、络合及铁硫还原溶解作用。表1.1给出了典型金属硫化矿和金属氧化矿晶体结构和化学式；表1.2给出了与硫化矿作用的典型铁/硫氧化微生物类型及其生理生化特征。
图1.3 微生物对硫化矿的铁硫氧化作用机理
MS为金属硫化矿；IOMs为铁氧化微生物；SOMs为硫氧化微生物
表1.1 典型金属硫化矿和金属氧化矿晶体结构和化学式（陈平，2006）
表1.2 与硫化矿作用的典型铁/硫氧化微生物类型及其生理生化特征

目录 第1章 微生物–矿物相互作用的基本原理 1 1.1 微生物–矿物相互作用的宏观效应 1 1.1.1 微生物参与酸性矿坑水的形成 1 1.1.2 微生物引起岩石矿物的风化和腐蚀 2 1.1.3 微生物参与矿物的形成 2 1.1.4 微生物参与矿物元素的地球化学循环 3 1.1.5 矿物的生物浮选 3 1.1.6 矿山环境的微生物修复 4 1.2 微生物–矿物相互作用的类型 4 1.3 微生物–矿物相互作用的过程 8 1.3.1 硫化矿物的生物溶解途径 8 1.3.2 微生物–矿物相互作用方式 9 第2章 微生物–矿物相互作用的研究策略与技术 13 2.1 微生物–矿物相互作用的研究策略 13 2.2 基于同步辐射的X 射线吸收谱学技术 15 2.2.1 同步辐射光源 15 2.2.2 基于同步辐射的X 射线吸收近边结构光谱 17 2.2.3 基于同步辐射装置的其他测试方法 21 2.3 辅助分析方法 23 2.3.1 显微镜检方法 23 2.3.2 组学技术 27 2.3.3 色谱技术 31 2.3.4 Zeta 电位测定方法 32 2.3.5 差热–热重/微量热测定方法 32 2.3.6 电化学分析方法 33 第3章 典型硫化矿生物吸附的表界面化学基础 39 3.1 密度泛函理论及分子动力学 39 3.1.1 密度泛函理论 39 3.1.2 分子动力学 41 3.2 典型矿物的晶体结构和能带结构 42 3.2.1 晶体结构 42 3.2.2 能带结构 44 3.3 硫化矿物选择性生物吸附的分子模拟 46 3.3.1 微生物表面功能基团与黄铁矿相互作用的计算 46 3.3.2 微生物表面功能基团与黄铜矿相互作用的计算 48 3.4 典型硫化矿物表面结构及选择性生物吸附行为：以黄铜矿为例 49 第4章 典型硫化矿–微生物作用过程元素形态转化及赋存形式 55 4.1 黄铜矿–微生物作用过程硫铁铜形态转化及赋存形式 55 4.1.1 含硫、铁、铜标样的XANES 光谱 55 4.1.2 不同温度特性微生物的影响 58 4.1.3 温度、矿浆浓度和pH 的影响：以万座嗜酸两面菌为例 67 4.1.4 晶体结构的影响：以万座嗜酸两面菌为例 74 4.1.5 催化剂的影响：以万座嗜酸两面菌为例 77 4.2 砷黄铁矿–微生物作用过程砷铁硫形态转化及赋存形式 86 4.3 黄铁矿–微生物作用过程铁硫形态转化及赋存形式 90 第5章 微生物–黄铜矿作用过程群落结构与硫氧化活性演替 93 5.1 微生物–黄铜矿作用过程中的表观硫氧化活性 93 5.2 硫氧化活性相关基因的筛选和鉴定 96 5.2.1 RNA 的提取及反转录 96 5.2.2 硫氧化活性相关基因的筛选 97 5.2.3 硫氧化活性相关基因的鉴定 98 5.3 嗜热古菌硫氧化活性的分子表征 101 5.4 嗜热古菌混合菌群落结构变化 104 5.5 嗜热古菌群落演替及其与黄铜矿浸出率的对应关系 110 5.5.1 不同温度下嗜热古菌群落演替及其与黄铜矿浸出率的关系 110 5.5.2 不同pH 下嗜热古菌群落演替及其与黄铜矿浸出率的关系 111 5.6 嗜热古菌–黄铜矿作用过程中的硫氧化活性及硫形态 113 5.6.1 嗜热古菌及其混合菌的硫氧化活性 114 5.6.2 嗜热古菌及其混合菌作用黄铜矿过程的比较 115 5.6.3 黄铜矿的表面硫形态分析 117 5.7 嗜热古菌–黄铜矿作用过程中各因素的关联 118 5.7.1 灰色关联理论 119 5.7.2 硫氧化活性–群落结构–硫形态的灰色关联分析 120 第6章 嗜酸硫氧化菌胞内外硫（球）分子形态 124 6.1 嗜酸硫氧化菌作用下S0 的化学形态转变：以A.ferrooxidans 为例 124 6.1.1 A.ferrooxidans 对Fe2+和S0 利用的差异 124 6.1.2 A.ferrooxidans 作用前后α-S8 的红外和硫K 边XANES 光谱 125 6.1.3 A.ferrooxidans 细胞亚微结构特征 127 6.1.4 A.ferrooxidans 细胞的硫K 边XANES 光谱 127 6.1.5 A.ferrooxidans 胞外蛋白质组硫K 边XANES 光谱 128 6.1.6 A.ferrooxidans 菌毛蛋白硫K 边XANES 光谱 129 6.2 嗜酸硫氧化菌胞内外硫（球）的化学形态差异：以A.ferrooxidans 和A.caldus 为例 130 6.2.1 A.ferrooxidans 和A.caldus 对S0 和S2O32–利用的差异 130 6.2.2 A.ferrooxidans 和A.caldus 在S0 和S2O32–中生长细胞显微结构的差异 130 6.2.3 A.ferrooxidans 和A.caldus 胞内外硫球硫K 边XANES 光谱 131 第7章 典型嗜酸硫氧化菌利用不同形态S0 的分子基础 135 7.1 不同形态单质硫的制备及表征 135 7.2 典型嗜酸硫氧化菌对α-S8 和μ-S 利用的差异 136 7.3 典型硫氧化菌对α-S8 和μ-S 硫形态转化的差异 140 7.4 典型嗜酸硫氧化菌对不同形态S0 转化的分子基础 145 7.4.1 胞外硫活化相关蛋白质基因的筛选 145 7.4.2 胞外硫活化相关蛋白质编码基因的功能验证 155 第8章 嗜酸铁/硫氧化微生物生物膜 158 8.1 生物膜的形成过程 158 8.1.1 自然界中的生物膜 158 8.1.2 生物膜在固体表面的形成过程 158 8.1.3 有关硫化矿表面生物膜的研究 159 8.2 生物膜观察与分析 160 8.2.1 生物膜形成过程观察 161 8.2.2 胞外成分原位分析 164 第9章 嗜酸铁/硫氧化微生物胞外多聚物 167 9.1 EPS 结构与组成 167 9.2 EPS 性质对能源底物的响应 168 9.2.1 嗜酸氧化亚铁硫杆菌适应元素硫细胞表面性质的变化 168 9.2.2 不同能源底物对万座嗜酸两面菌细胞表面性质的影响 171 9.3 EPS 组成与能源底物关联性 176 9.4 EPS 铁/碳赋存形态与能源底物的关联性 180 9.4.1 典型浸矿菌细胞表面铁赋存形态 180 9.4.2 典型浸矿菌细胞表面碳赋存形态 186 第10章 嗜酸氧化亚铁硫杆菌硫代谢相关特化细胞空间蛋白质 188 10.1 嗜酸氧化亚铁硫杆菌细胞结构特征 188 10.2 特化细胞空间比较蛋白质组学 189 10.2.1 特化细胞空间蛋白质选择性提取 189 10.2.2 双向电泳分离 190 10.2.3 归类及生物信息学分析 191 10.2.4 硫氧化相关蛋白质功能验证 201 10.3 元素硫活化/氧化机制 203 10.3.1 元素硫活化/氧化相关蛋白质 203 10.3.2 硫活化相关表面蛋白质巯基原位表征 210 10.3.3 硫活化/氧化模型 213 参考文献 214