第1章 CRISPR-Cas系统概述 001 1.1 引言 002 1.2 CRISPR-Cas分类 003 1.3 2类CRISPR-Cas系统 004 1.4 CRISPR-Cas系统的递送方法 005 1.5 CRISPR-Cas系统的非基因组编辑方法 005 1.5.1 用CRISPR-Cas13和rCas9靶向RNA 005 1.5.2 CRISPRa/CRISPRi、表观遗传修饰和标记 006 1.6 CRISPR-Cas商业化现状 007 1.7 结语 007 参考文献 008 第2章 基因编辑技术史话 011 2.1 引言 012 2.2 基因编辑技术的历史先河:基因打靶技术 012 2.3 昙花一现:锌指核酸酶技术和类转录激活因子效应物核酸酶技术 015 2.4 革命时代的来临:CRISPR技术 018 2.5 结语 021 参考文献 022 第3章 基于CRISPR-Cas系统的基因编辑技术���进展 025 3.1 引言 026 3.2 基因编辑技术的发展 026 3.3 CRISPR-Cas系统的多样性、分类与演变 028 3.3.1 CRISPR-Cas系统分类及作用原理 028 3.3.2 CRISPR-Cas系统的源起和进化 029 3.4 CRISPR-Cas系统的应用进展 031 3.4.1 在细菌及古菌中的应用 031 3.4.2 在真菌中的应用 032 3.4.3 在植物细胞中的应用 033 3.4.4 在动物细胞中的应用 034 3.5 CRISPR-Cas系统的前瞻性应用 035 3.6 结语 037 参考文献 037 第4章 CRISPR-Cas9的结构和作用机制 043 4.1 引言 044 4.2 CRISPR-Cas9生物学 044 4.3 Cas9酶 046 4.3.1 Apo酶的双叶结构 046 4.3.2 HNH和RuvC核酸酶结构域 047 4.4 CRISPR-Cas9效应复合物的组装 047 4.4.1 sgRNA结合后的构象重排 048 4.4.2 Cas9与sgRNA的相互作用 048 4.4.3 预排序种子RNA以及Cas9与PAM的相互作用 049 4.5 目标搜索与识别 049 4.5.1 RNA-DNA异源双链 050 4.5.2 PAM识别 051 4.5.3 局部DNA熔解和R环形成 051 4.5.4 Cas9诱导的DNA弯曲 053 4.6 靶标切割 053 4.6.1 解偶联的DNA结合和切割事件 054 4.6.2 通过HNH-RuvC通讯进行DNA协同切割 054 4.6.3 非靶DNA链在HNH重定位中的关键作用 055 4.7 CRISPR-Cas9介导的DNA靶向和切割模型 056 4.8 Cas9直系同源物的结构 056 4.9 结语 057 参考文献 058 第5章 CRISPR介导的表观遗传学编辑 063 5.1 引言 064 5.2 针对组蛋白的表观修饰 065 5.2.1 转录激活 065 5.2.2 转录** 066 5.2.3 目前的局限性 067 5.2.4 克服当前局限性 069 5.3 针对DNA的表观修饰研究 070 5.3.1 DNA甲基化 070 5.3.2 DNA去甲基化 071 5.3.3 使用CRISPR介导的方法探测新的DNA表观遗传修饰 072 5.3.4 m5dC衍生物的氧化 072 5.3.5 N6-甲基脱氧腺苷的发现 072 5.3.6 发现新的DNA表观遗传修饰 073 5.4 针对非编码RNA的表观遗传学功能 074 5.5 化学和光诱导基因组表观编辑 075 5.6 表观基因组编辑与病理和** 076 5.7 超越CRISPR-Cas9 077 5.8 结语 078 参考文献 080 第6章 CRISPR-Cas9的脱靶效应 089 6.1 引言 090 6.2 *小化CRISPR-Cas9系统脱靶效应的策略 091 6.2.1 改善sgRNA-Cas9复合物的有效浓度和sgRNA-Cas9复合物递送 091 6.2.2 sgRNA分子的合理设计 093 6.2.3 新的Cas9变体的合理工程设计 094 6.2.4 Cas9直系同源物 095 6.2.5 Ⅱ类Cas9直系同源物 096 6.3 CRISPR-Cas9系统中脱靶效应的检测方法 098 6.3.1 预测的脱靶位点检测 099 6.3.2 WGS 099 6.3.3 ChIP-seq 099 6.3.4 IDLV捕获 100 6.3.5 BLESS 100 6.3.6 GUIDE-seq 101 6.3.7 LAM-HTGTS 101 6.3.8 Digenome-seq 102 6.3.9 SITE-seq 102 6.3.10 CIRCLE-seq 103 6.3.11 GOTI 103 6.3.12 PEM-seq 104 6.3.13 DISCOVER-seq 104 6.4 结语 105 参考文献 105 第7章 CRISPR-Cas9的实验模型 112 7.1 引言 113 7.2 细胞模型 114 7.3 动物模型 118 7.3.1 鼠 118 7.3.2 果蝇 120 7.3.3 斑马鱼 121 7.3.4 猪 123 7.3.5 其他动物模型 123 7.4 植物 125 7.5 真菌 127 7.6 细菌 129 7.7 结语 133 参考文献 133 第8章 纳米材料递送CRISPR-Cas系统 136 8.1 引言 137 8.2 纳米材料概述 137 8.2.1 纳米材料定义及特性 137 8.2.2 纳米材料的分类 138 8.2.3 纳米材料的应用 138 8.3 基因疗法简介 139 8.4 纳米材料递载CRISPR-Cas系统的生物应用 140 8.4.1 二维纳米材料递送CRISPR-Cas系统的生物应用 140 8.4.2 贵金属及自组装纳米材料递载CRISPR-Cas系统的生物应用 143 8.4.3 其他纳米材料递载CRISPR-Cas系统的生物应用 145 8.5 结语 146 参考文献 147 第9章 全基因组CRISPR-Cas9基因敲除和转录激活筛选的实验方案 149 9.1 引言 150 9.2 实验设计 151 9.2.1 筛选方法 151 9.2.2 sgRNA文库的设计和选择 151 9.2.3 构建和递送sgRNA文库的方法 152 9.2.4 选择sgRNA 153 9.3 材料 155 9.3.1 试剂 155 9.3.2 耗材及设备 160 9.3.3 试剂制备 162 9.3.4 材料准备 164 9.3.5 步骤 164 9.4 结语 189 参考文献 189 第10章 细菌中的CRISPR-Cas系统及其功能 191 10.1 引言 192 10.2 细菌中CRISPR的分布 193 10.3 CRISPR-Cas系统在细菌研究中的应用 194 10.3.1 对细菌基因组进行编辑 194 10.3.2 参与细菌基因的表达调控 195 10.3.3 与细菌生物膜、毒力和细菌耐药的关系 196 10.3.4 参与细菌与宿主的相互作用 196 10.3.5 与细菌分型的关系 197 10.3.6 基于CRISPR系统的细菌进化分析 198 10.3.7 与核酸检测的关系 198 10.4 CRISPR-Cas系统的应用可能带来的伦理问题及有害影响 200 10.5 结语 201 参考文献 201 第11章 CRISPR-Cas技术在抵抗病原微生物感染中的应用 206 11.1 引言 207 11.2 CRISPR-Cas9基因编辑系统在病毒相关疾病**中的应用 207 11.3 CRISPR-Cas9基因编辑系统在细菌和真菌中的应用 208 11.4 结语 209 参考文献 209 第12章 CRISPR-Cas9在免疫学研究中的应用 211 12.1 引言 212 12.2 CRISPR-Cas9在免疫相关疾病发病机制研究中的应用 212 12.2.1 造血系统恶性**疾病机制及动物模型研究 212 12.2.2 CRISPR-Cas9全基因组筛选用于研究复杂生命过程 213 12.3 CRISPR-Cas9在免疫相关疾病**中的应用 214 12.3.1 **免疫** 214 12.3.2 **HIV感染 215 12.4 结语 217 参考文献 218 第13章 CRISPR-Cas系统在核酸检测中的应用 220 13.1 引言 221 13.2 基于CRISPR-Cas系统的核酸检测分类 222 13.2.1 基于Cas9系统的核酸检测 222 13.2.2 基于CRISPR-Cas12和Cas14系统的DNA检测 223 13.2.3 基于CRISPR-Cas13系统的RNA检测 225 13.3 CRISPR-Cas核酸检测系统的优势及局限性 227 13.4 结语 227 参考文献 228 第14章 CRISPR-Cas9在疾病**中的应用 229 14.1 引言 230 14.2 CRISPR-Cas9系统在癌症生物学中的潜在应用 230 14.3 CRISPR-Cas9在遗传性疾病中的作用 231 14.4 CRISPR-Cas9在病毒性疾病中的作用 232 14.5 CRISPR-Cas9在神经系统疾病中的作用 234 14.6 CRISPR-Cas9在过敏和免疫疾病中的作用 234 14.7 结语 235 参考文献 236 第15章 CRISPR-Cas在传染病检测和**中的应用 237 15.1 引言 238 15.2 CRISPR-Cas生物学 238 15.2.1 获取间隔序列 239 15.2.2 crRNA生成 239 15.2.3 干扰 240 15.3 CRISPR-Cas9技术概述 242 15.3.1 CRISPR-Cas9基因工程 242 15.3.2 sgRNA文库用于筛选基因型-表型 242 15.3.3 使用失活的Cas9调节基因转录 242 15.4 在传染病中的应用 243 15.4.1 了解宿主与病原体的相互作用 243 15.4.2 在传染病诊断中的应用 244 15.4.3 CRISPR-Cas在**中的应用 246 15.5 结语 249 参考文献 251