《医学微生物实验学》包括微生物实验的基本技术,细菌学、真菌学及病毒学实验,临床 标本的综合性实验及实验设计和微生物非培养法鉴定技术等6部分内容, 分为44项共131个实验。内容涉及微生物学的实验原理和基础技术,各种 微生物的系统检验,各种临床标本的检测方法,技术方法详实,图文并茂。 其中非培养法鉴定技术是针对难培养或不能培养微生物的感染难以进行病 原学检测的瓶颈而设计的。并针对目前仍以微生物的分离培养作为病原学 诊断的“金标准'提出要以非培养法鉴定技术替代微生物的分离培养,建 立新的病原学诊断“金标准”。同时针对教育部倡导大学生创新能力和临 床技能培养的教育理念,《医学微生物实验学》着重强化了临床标本的综合性实验及实验设 计部分,以锻炼大学生在综合性实验中的综合分析能力和实践操作能力。 要完成《医学微生物实验学》全部实验内容约需100学时,各校可根据各自特点和专业要 求选择适当的教学内容。 医学微生物实验学(第4版)_黄敏_科学出版社_

**部分微生物实验的基本技术
随着科学技术的不断进步,标准化、自动化正在成为微生物学实验诊断的发展趋势。医学微生物实验学以病原微生物的表现型和基因型为研究对象,采用微生物学的经典技术(如革兰染色、琼脂培养、生化试验、**敏感试验等),现代免疫学技术(血清学诊断等)以及分子生物学相关技术(核酸分子杂交、PCR、基因芯片等)X办病原微生物的不同层面进行分析,为诊断和**感染性疾病奠定实验基础。本书遵?学性、先进性、启发性的原则,概括了微生物学实验的鉢原理与施,较为系统全面績病原敝物的形态、生酿化紙遗传变异、代谢产物以雜病性等进行深入織,培养医学生的无菌操作能力,获得对病原触物的正确认识。
**实验细菌的人工培养法
细菌在自然界和人体中广泛分布,且多为正常菌群。待检标本中的病原菌常与其他���菌混杂在一起,只有获得目的菌的纯培养,才能进一步研究其生物学特性,因此,感染性疾病的诊断关键在于病原菌的分离与鉴定。细菌的人工培养就是为细菌的生长提供必要的营养和条件,如温度、湿度、酸碱度、气体环境及适合的培养基。纯培养获得的细菌还可用于生物制品的制备。
实验1基础培养基的制备
培养基是用人工方法将适合细菌生长繁殖的各种养分混合而成的营养基质。培养基种类很多,根据用途培养基可分为基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基以及厌氧培养基等;根据物理性状的不同又可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。基础培养基中含有水分、碳源、氮源、无机盐等营养物质,可供大多数细菌生长繁殖。在基础培养基中增添某些特殊成分(如糖类、血液、**剂、指示剂等)则可制成有特殊用途的营养培养基、鉴别培养基和选择培养基。
培养基的制备原则:①充足的营养;②适合的酸碱度;③无菌。
制备培养基的基本流程为:a.按配方称取原材料;b.加水溶解;c.调整酸碱度;d.分装及**。目前大多数实验室使用商品化的半成品培养基,只需加水溶解,分装**即可使用。
一、液体培养基的制备
【材料】
(1)营养肉汤粉(含牛肉膏,蛋白胨及氯化钠)、蒸馏水、NaOH溶液。
(2)玻璃棒、吸管、三角烧瓶、量筒、天平、试管等。
【方法】
称取营养肉汤粉1.8g(含牛肉膏0.3g,蛋白胨lg、氯化钠0.5g)加入100ml蒸馏水中,加热搅拌至溶解并调整pH为7.2?7.6。试管分装及包装后置高压蒸汽**器内,在103.4kPa压力下,维持15?20min。冷却后贴好标签,放人37T温箱24h,无细菌生长则置于4T冰箱t存备用。制成后的液体培养基呈浅黄色,清晰透明。液体培养基常用于增菌培养,大规模工业生产及进行实验室微生物研究。
二、琼脂固体培养基的制备
琼脂是从海藻石花菜中提出的一种半乳糖胶,对细菌无营养作用,其熔点为981,低于45T,则呈现凝胶状态,加入液体培养基中可使之固化形成固体培养基。
【材料】
(1)液体培养基、琼脂。
(2)试管、平皿。
【方法】
在液体培养基中加入2%琼脂即成。经高压**后,趁热将试管斜置、冷凝(培养基约占试管长度的2/3),即成普通琼脂斜面培养基;或待琼脂培养基冷至50?601时,以无菌操作倾入**的空培养皿,冷凝后即为普通琼脂平板(9cm直径的平皿需培养基15?20ml)。琼脂平板培养基用于细菌的分离培养;琼脂斜面培养基用于纯培养、保存菌种及观察细菌的某些生化特性。
半固体培养基是在上述液体培养基中加入0.3%?0.5%琼脂,加热溶化后,分装于小试管(lOmmXlOOmm),每管约3ml,经高压**后取出直立冷凝即成。半固体培养基用于检查细菌的动力和细菌菌种的保存。
实验2细菌的分离与接种法
培养细菌时,根据研究目的和细菌生长条件的差异,需采用不同的接种技术和培养方法。细菌的分离培养方法有很多种,其中平板划线分离是用接种工具在平板培养基表面划线,将混杂在一起的细菌分散开来,使单个细菌能在某一点上繁殖并形成菌落。纯种的细菌可进一步接种相关的培养基如斜面、半固体、液体培养基以检验生物学性状及获得纯培养。接种工具末端为耐热金属丝,包括接种环和接种针,接种环用来挑取标本、涂划平板,而接种针用来挑取单个菌落、穿刺接种等。接种工具使用前后必须通过火焰灼烧**,如图i-1-i。
一、平板划线分离培养法
四区划线是平板分离细菌中较为常用的技术,能有效稀释细菌获得单个菌落,为进一步鉴定细菌提供条件。
【材料】
(1)菌种:葡萄球菌和大肠埃希菌混合菌液。
(2)培养基:琼脂平板。
(3)接种环,酒精灯。
【方法】
(1)烧灼**接种环,待冷,以接种环取一环混合菌液。
(2)左手立即斜持平板(45°角),靠近火焰周围,丨用手指打开平皿上盖,使之一端与平皿底形成3cm左右的缝隙,右手持已取材的接种环,在平板表面上侧接近玻璃边缘的原始部位以30°?40°角度迂回密集划线形成第1区,然后烧灼接种环,待冷后,逆时针转动平板90°,稍微通过原始部位从1区引出直线并密集划线作为第2区,重新烧灼接种环如此再重复两次,划出第3区及第4区。四个区以占据整个平板为宜,划线密集且不重叠(图1-1-2)。
图1-1-2平板四区划线法
(3)接种完毕,烧灼接种环完成**,盖上培养皿,并在平板底玻璃上注明标本(菌种)名称及接种者信息,倒置平板(防止平皿干燥及冷凝水冲散菌落)并放于371孵箱培养。
(4)结果观察:培养18?24h后取出,观察平板表面细菌生长情况及菌落特征,一般情况下,菌落是由分散出来的单个细菌经过18?24h培养形成的肉眼可见的细菌集团。在菌量多的部分,菌落常融合成片,形成菌苔,菌苔不能作为鉴定的依据。而菌落为鉴定细菌的重要指标之一,观察项目主要有以下几点:
1)大小:菌落直径通常以mm表7K。
(大菌落直径大于4mm;中等菌落直径2?4mm;小菌落直径小于2mm)
2)形状:圆形、卵圆形、不规则形、放射状等。
3)颜色:无色、白色、黄色、绿色等。
在某些鉴别和选择培养基上,细菌生长过程中会形成一定颜色,如伊红美蓝平板上大肠杆菌形成紫黑色有金属光泽的菌落,这是由于大肠杆菌发酵乳糖产酸,使伊红和美蓝结合成络合物而显色,与细菌本身产生色素不同。
4)边缘:整齐、不整齐(可出现锯齿状、毛发状等)。
5)隆起度:扁平、凸起、**凹陷等。
6)表面:光滑、粗糙、皱纹、颗粒状等;湿润(有光泽)、干燥(无光泽)等。
7)透明度:透明、半透明、不透明等。
8)溶血性:细菌在血琼脂培养基上生长可产生完全溶血(p型溶血),不完全溶血(ot型溶血)和不溶血几种现象。
9)菌落可依据以上观察特点分为三个类型:①光滑型菌落(smoothtypecolony):又称S型菌落,特点为菌落表面光滑湿润、边缘整齐。②粗糙型菌落(roughtypecolony):又称R型菌落,特点为菌落表面粗糙干燥、边缘不整齐。③黏液型菌落(mucoidtypecolony):又称M型菌落,特点为菌落表面光滑湿润、呈黏液状,以接种环触之可拉出丝状物。
二、斜面培养基接种法
琼脂斜面培养基一般供细菌繁殖,主要用于细菌纯培养和传代,以便进一步鉴定和保存菌种,某些特殊斜面培养基可用作于观察生化反应等。
【材料】
(1)菌种:大肠埃希菌、葡萄球菌斜面培养物。
(2)培养基:琼脂斜面培养基。
(3)接种环,酒精灯。
【方法】
(1)将菌种管与培养管置于左手食指、中指和无名指之间,拇指压住试管底部上方,管口朝上置于火焰旁。菌种管位于近火焰一侧,接种管位于外侧。
(2)右手执接种环(姿势与握铅笔相似),火焰烧灼**Q
(3)以右手手掌与小指、小指与无名指分别拔取并夹持两管棉塞(先外后内),并将两管管口迅速通过火焰**。
(4)将**并冷却的接种环伸入菌种管,从斜面上取菌苔少许,退出菌种管,迅速伸人待接种的培养管,在斜面上先由底部向上拉一条线,再从斜面自下而上轻轻迂回连续划线,沾菌的接种环进出试管时,均不应触及试管内壁及管口(图1-1-3)。
(5)取出接种环,在火焰上**管口,塞上棉塞(先菌种管,后接种管),然后**接种环,做好标记。置于37T温箱孵育18?24h,观察结果。
(6)结果观察:细菌在培养管中的接种线上,生长出的大量细菌连成一片,形成了菌苔。不同种的细菌菌苔,其透明度、颜色等特征均不同。
三、液体培养基接种法
肉汤、蛋白胨水、各种单糖发酵管等液体培养基都用本法接种细菌。普通液体培养基一般作增菌及观察细菌的生长状况使用。其他的液体培养基接种后,大多用以测定生化特性。
【材料】
(1)菌种:大肠埃希菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌斜面培养物。
(2)培养基:液体培养基。
(3)接种环,酒精灯。
【方法】
(1)与斜面培养基同法握持菌种管及接种管。
(2)接种环**冷却,挑取少量菌荅,伸入待接种的培养基管内,在接近液面的管壁处轻轻研磨(图1-1-4),然后将试管稍摇动,使菌种混匀于液体中即可。
(3)接种完毕,标记试管及接种信息,将培养管置于371温箱孵育18?24h,观察结果。
(4)结果观察:液体培养基在未接种细菌前是澄清的,接种细菌后可有以下三种生长现象:
1)均匀混浊生长:一般情况下大多数细菌在液体中变混浊。
2)沉淀生长:上层培养液澄清,管底有絮状或颗粒状沉淀物,一般见于死菌或密度大的
3)形成菌膜:培养液相对澄清,表面形成一层菌膜,常见于专性需氧菌。
四、穿剌接种法
穿刺接种法主要用于半固体培养基、乙酸铅培养基和KIA培养基等的接种,以保存菌种,观察细菌动力及生化反应。
【材料】
(1)菌种:变形杆菌、葡萄球菌斜面培养物。
(2)培养基:半固体琼脂培养基和乙酸铅培养基。
(3)接种针,酒精灯。
【方法】
(1)如斜面培养基接种法握持菌种管及待接种管培养基。
(2)右手持接种针,**冷却后,以针挑取菌苔接种于半固体培养基时,垂直刺入培养基的**接近底部0.5cm处,然后按原路退出(图1-1-5)。
(3)接种完毕,管口通过火焰**,塞上棉塞,接种针**后放回。试管上注明菌名、接种者信息及日期,置于37T温箱,培养18?24h后观察生长情况。
(4)结果观察:半固体培养基用于观察细菌有无动力,无鞭毛细菌沿接种线生长,接种线清晰无扩散,培养基澄清;有鞭毛细菌沿着接
种线向外扩散,呈毛刷状生长。乙酸铅培养基观察有无黑色沉淀物形成。
(周慧敏)
第二实验细菌形态学检查法
实验3显微镜的使用
细菌个体微小,肉眼不能看到,必须借助普通显微镜之油镜,将其放大1000倍左右才能看清。因此,必须熟练掌握显微镜的使用和保护,尤其是油镜的使用和保护。
基本原理是光线从标本玻片经空气进人镜头时,由于介质密度不同而发生折射现象,因此,进人物镜中的光线很少,结果视野很暗,物像不清晰。如在玻片上加上折光率与玻片(n=1.52)相近的香柏油(ra=l.515),就可避免光线的分散,加强视野的亮度,获得清晰的物像。
【材料】
显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸。
【方法】
(1)油镜的识别:油镜头上都有标记;标有90x或100x;镜头前端有黑、白或红色的圆圈;刻有“m”或Oil等,其入光孔径也较其他物镜小。
(2)油镜的使用(观察细菌的形态)
1)显微镜平稳地安放在实验台适宜处。
2)以天然光线为光源时,使用平面反光镜;以灯光为光源时,使用凹面反光镜。
3)把集光器升到*高位置,光圈完全打开,增大射人光线的强度。
4)将标本固定在载物台上,先把低倍镜调至视野*亮,并找到标本视野的适当位置,然后换用油镜。
5)先在玻片上滴香柏油1滴,用眼从侧方看着物镜,缓慢转动粗调节器,使物镜头浸于油镜内,至与玻片几乎接触为止,但勿使两者相碰,防止损伤镜头或玻片。然后从目镜观察,仔细转动粗调节器,看到模糊物像时,再调动细调节器,使物像清晰。未能看到物像时,可重复上述操作。
6)油镜头使用后应立即用擦镜纸滴少许二甲苯擦净镜头上的油,并随即用干的擦镜纸擦去二甲苯,以防止腐蚀镜片。注意:在擦镜纸擦拭时,要求顺一个方向旋转擦,不能两个方向来回擦。
(3)显微镜的保护
1)显微镜使用时要精心保护,不得随意拆散和碰撞。
2)取送显微镜时,应右手持镜臂,左手托镜座,平端于胸前。
3)不用时,将物镜转开呈“

**部分微生物实验的基本技术
**实验细菌的人工培养法(1)
实验1基础培养基的制备(1)
实验2细菌的分离与接种法(2)
第二实验细菌形态学检查法(6)
实验3显微镜的使用(6)
实验4细菌不染色标本检查法(悬滴法)(6)
实验5细菌涂片的制备及革兰染色法(7)
实验6细菌的基本形态和特殊结构观察(8)
第三实验细菌生化鉴定法(9)
实验7单糖发酵试验(9)
实验8触酶试验(9)
实验9氧化酶试验(10)
实验10IMViC试验(10)
实验11硫化氢试验(12)
实验12尿素酶试验(12)
实验13数字编码测定法(13)
第四实验细菌血清学鉴定法(15)
实验14凝集试验(15)
实验15沉淀试验(毛细管法)(18)
实验16荚膜肿胀试验(18)
第五实验消毒与**(20)
实验17常用消毒?**法及**滤器的使用(20)
实验18常用化学消毒剂对细菌的影响(24)
实验19噬菌体的特异溶菌试验(25)
第六实验细菌抗生素敏感性测定(27)
实验20纸片扩散法(27)
实验21稀释法(28)
实验22E试验(30)
第七实验细菌的遗传与变异(33)
实验23细菌变异现象的观察(33)
实验24R质粒的传递试验(34)
实验25质粒DNA转化试验(35)
实验26细菌DNA提取(36)
第八实验实验动物及细菌毒素检测(37)
实验27实验动物的管理与选择(37)
实验28动物接种与采血技术(38)
实验29细菌毒素检测(40)
第九实验医院内感染监测与质量控制(42)
实验30空气消毒效果的监测(42)
实验31物体表面细菌污染监测(42)
实验32医护人员手细菌污染监测(43)
实验33使用中的消毒液与无菌器械保存液污染监测(44)
实验34压力蒸汽**器**效果监测(45)
实验35紫外线灯的消毒效果监测(46)
实验36无菌试验(47)
第二部分细菌学实验
第十实验球菌(49)
实验37葡萄球菌属(49)
实验38链球菌属(52)
实验39抗链球菌溶血素“O”试验(53)
实验40奈瑟菌属(54)
第十一实验肠杆菌科(56)
实验41埃希菌属(56)
实验42沙门菌属(57)
实验43志贺菌属(58)
实验44肥达(Widal)试验(59)
实验45变形杆菌属(60)
第十二实验弧菌属(61)
实验46霍乱弧菌(61)
实验47副溶血弧菌(62)
第十三实验弯曲菌属和螺杆菌属(65)
实验48弯曲菌属(65)
实验49螺杆菌属(67)
第十四实验厌氧菌(69)
实验50厌氧芽胞梭菌(69)
实验51无芽胞厌氧菌(71)
第十五实验革兰阳性杆菌(73)
实验52棒状杆菌属(73)
实验53炭疽芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌(74)
实验54李斯特菌属(75)
第十六实验分枝杆菌属及诺卡菌属(76)
实验55结核分枝杆菌(76)
实验56麻风分枝杆菌(78)
实验57诺卡菌属(79)
第十七实验非发酵革兰阴性杆菌(80)
实验58假单胞菌属(80)
实验59不动杆菌属(82)
第十八实验其他细菌(83)
实验60嗜血杆菌属(83)
实验61军团菌属(84)
第十九实验API鉴定系统在细菌学检验中的应用(86)
实验62API20E系统用于肠杆菌科的鉴定(86)
实验63API20NE系统用于非发酵菌的鉴定(89)
实验64APIRapidID32A用于厌氧菌的鉴定(91)
第二十实验螺旋体(95)
实验65螺旋体的形态���察(95)
实验66钩端螺旋体(95)
实验67梅毒螺旋体(97)
实验68伯氏疏螺旋体(99)
第二十一实验支原体(101)
实验69肺炎支原体形态及菌落观察(101)
实验70肺炎支原体冷凝集试验(101)
实验71ELISA方法检测肺炎支原体IgG/IgA/IgM抗体(102)
实验72溶脲脲原体脲酶试验(104)
第二十二实验衣原体(105)
实验73沙眼衣原体包涵体的形态观察(105)
实验74直接免疫荧光法检测沙眼衣原体(105)
实验75ELISA法检测衣原体(107)
实验76细胞培养分离衣原体(108)
第二十三实验立克次体(109)
实验77立克次体的形态与染色(109)
实验78外斐反应(110)
第三部分真菌学实验
第二十四实验真菌的基本性状(112)
实验79真菌染色及形态结构的观察(112)
实验80真菌的培养(114)
实验81真菌的生化及鉴定试验(115)
实验82真菌的药敏试验(116)
第二十五实验常见浅部真菌的鉴定(117)
实验83毛癣菌属(117)
实验84小孢子菌属(117)
实验85表皮癣菌属(118)
第二十六实验常见深部真菌的鉴定(119)
实验86假丝酵母菌属(119)
实验87隐球菌属(120)
实验88曲霉菌属(121)
第四部分病毒学实验
第二十七实验病毒的分离培养技术(122)
实验89病毒的动物接种法(122)
实验90鸡胚培养法(123)
实验91病毒组织培养法(125)
实验92水泡性口炎病毒在细胞上的感染性测定(127)
第二十八实验呼吸道病毒(129)
实验93流感病毒的分离与鉴定(129)
第二十九实验肠道病毒(132)
实验94肠道病毒的分离鉴定(132)
实验95轮状病毒的检测(133)
第三十实验肝炎病毒(137)
实验96ELISA法检测甲型肝炎病毒IgM抗体(137)
实验97PCR法检测HBVDNA(138)
实验98PCR法检测HCVRNA(139)
第三十一实验人类免疫缺陷病毒(141)
实验99ELISA法检测HIV抗体筛选试验(141)
实验100蛋白印迹法检测HIV抗体(142)
第三十二实验疱疹病毒(145)
实验101抗单纯疱疹病毒抗体检查(145)
实验102PCR法检测HSVDNA(146)
实验103生物素-链霉亲和素系统ELISA检测抗巨细胞病毒抗体(147)
第三十三实验虫媒病毒(149)
实验104乙型脑炎病毒IgM抗体检测(149)
实验105登革病毒(150)
第五部分临床标本的综合性实验及实验设计
第三十四实验血液标本病原学鉴定(151)
实验106血液标本的病原菌鉴定(151)
第三十五实验尿液及生殖道标本病原学鉴定(154)
实验107尿液标本的病原菌鉴定(154)
实验108生殖道标本的病原菌鉴定(157)
第三十六实验粪便标本病原学鉴定(160)
实验109粪便标本的病原菌鉴定(160)
第三十七实验脓汁标本的病原学鉴定(163)
实验110脓汁标本的病原菌鉴定(163)
第三十八实验痰液及呼吸道标本病原学鉴定(166)
实验111痰及呼吸道标本病原菌鉴定(166)
实验112免疫功能低下与机会性感染(169)
第三十九实验无菌体液标本(171)
实验113脑脊液标本的病原菌鉴定(171)
实验114穿刺液标本常见病原菌的鉴定(173)
第四十实验设计性实验(176)
实验115临床检测方案的设计(176)
实验116新方法?新技术的设计(176)
实验117暴发流行的实验室工作(179)
第六部分微生物非培养法鉴定技术
第四十一实验临床标本的直接显微镜检查(181)
实验118微生物形态学检查(181)
实验119荧光染色试验(182)
实验120病毒的电子显微镜观察(183)
第四十二实验细菌特异性蛋白质及抗原的检测(185)
实验121直接荧光抗体染色法(185)
实验122胶体金法检测结核杆菌抗体(186)
实验123ELISA夹心法检测葡萄球菌肠毒素(186)
第四十三实验核酸检测技术(188)
实验124细菌的培养和破壁(188)
实验125DNA的提取(188)
实验126固相膜分子杂交(191)
实验127原位杂交(193)
实验128PCR技术(194)
实验12916SrRNA的寡核苷酸序列分析(195)
第四十四实验气相与液相色谱技术(196)
实验130气相色谱(196)
实验131**液相色谱(197)
参考文献(199)
附录(200)
彩图

《医学微生物实验学》可供医药院校学生使用。另外,《医学微生物实验学》的技术和方法也可作为临床 微生物检验的操作指南,也是广大微生物学工作者的参考用书。