黑龙江省是我国大豆主要生产基地，加入世贸组织后，大豆面临严重的进口压力。主要原因是我国大豆单产低，竞争力不强。大豆属于短日照植物，其生长发育对光周期反应非常敏感，这一特性严重阻碍大豆品种的适应性，是制约大豆单产提高和稳产的关键因素。暗处理相当于短日照，可以缩短大豆的开花和成熟期，其表型之一是加速叶片的衰老。叶细胞的结构、代谢和基因表达都协调的发生变化，细胞器官的组分被依次有序的分解。代谢变化包括合成代谢活性的减弱，如光合作用和蛋白质的合成，以及分解代谢的加速，如核酸降解和蛋白水解。这些对维持植物生长和生殖是非常必要的，基因转录物丰度的巨大变化揭示了从有光合活性的叶片到作为流动营养物来源的衰老器官来维持发育的转变情况。
为了打破大豆种植区域的局限性，本研究在细胞分子水平上从基因差异表达的角度研究短日照光周期诱导开花和衰老过程中基因转录丰度的变化，克隆与大豆光周期反应及衰老有关的基因，从而探索大豆叶片感受日长变化诱导开花和衰老的复杂机制。虽然植物花器官的分化发生在顶端分生组织，在开花过程中的基因表达也必然在顶端分生组织中有所反映，然而植物感受光的器官是叶片，并利用长距离信号通过韧皮部传导

1 引言
1.1 植物开花机理的研究进展
植物的花发育分为开花诱导、花的发端和花器官发育三个阶段。开花是植物在生命周期过程中从营养生长向生殖发育所进行的重要转变，是植物有性生殖的重要一步，所以，植物必须**地控制开花，才能确保在适当的时间进行有性生殖和种子成熟。生殖生长是高等植物生活史中的重要阶段，而作为执行生殖过程的重要器官——花器官的形成和发育即成花机理更是一直受到生物学家和农学家的关注。
植物在营养生长的基础上、在一定的外界条件诱导下，茎尖分生组织从分化枝叶转为分化生殖器官（花芽），花芽的分化是植物由营养生长转入生殖生长的重要标志。大多数高等植物在其生活周期中均存在一个共同的特点，就是在开花之前要达到一定的年龄或处于一定的生理状态，然后才能具有接受外界环境诱导而开花的能力。植物在感受外界刺激而开花之前必须达到的生理状态称为花熟状态。植物在达到花熟状态之前的营养生长阶段称为幼年期（juvenile phase）。处于幼年期的植物即使满足了其开花所需的外界条件也不能开花。已经达到花熟状态的植物，也只有在适宜的外界条件下才能开花。也就是说当植物已达花熟状态时，外界环境的某些因素对植物的开花起主导作用。植物总是在合适的季节才能开花，而季节的变化主要与温度和日照长度的变化有关。研究证明，植物的开花与温度高低和日照长短有密切的关系。……

1 引言
1.1 植物开花机理的研究进展
1.1.1 植物花芽分化过程的调节机制
1.1.2 环境条件对植物成花的调控
1.2 大豆光周期现象的研究进展
1.2.1 大豆生育期性状的光周期反应特性
1.2.2 光周期对大豆农艺性状和籽粒品质的影响
1.2.3 大豆中光敏感性E等位基因的研究进展
1.2.4 大豆开花时间基因图谱的绘制
1.3 拟南芥开花诱导的分子生物学研究进展
1.3.1 光周期途径
1.3.2 春化促进途径
1.3.3 自主途径
1.3.4 赤霉素途径
1.3.5 染色质结构和开花**
1.3.6 拟南芥开花途径的整合
1.3.7 植物中的拟南芥开花途径的基因保守性
1.4 植物衰老的研究
1.4.1 衰老的生理生化反应特性
1.4.2 衰老学说
1.4.3 衰老的调控
1.5 RAV转录因子的研究进展
1.6 基因差异表达的研究方法
1.6.1 基于cDNA的PCR扩增方法
1.6.2 基于差减杂交的克隆方法
1.6.3 表达序列标签
1.6.4 基因表达系列分析
1.6.5 微阵列杂交
1.6.6 实时荧光定量PCR技术
1.7 植物遗传转化
1.7.1 植物遗传转化方法
1.8 研究目的和意义
2 材料和方法
2.1 实验材料和试剂
2.1.1 植物材料
2.1.2 菌种及载体
2.1.3 主要试剂
2.2实验方法
2.2.1 **性消减杂交(SSH)
2.2.2 **消减文库的构建
2.2.3 反向Northem blot斑点杂交筛选消减文库
2.2.4 测序及序列同源性检索
2.2.5 实时荧光定量PCR进一步验证差异表达的片段
2.2.6 RACE方法克隆大豆GmRAV基因
2.2.7 Real-time RT-PCR分析GmRAV的表达
2.2.8 植物表达载体pBI121-GmRAV的构建
2.2.9 农杆菌介导法转化烟草叶盘
2.2.10 转基因烟草的分子生物学检测
2.2.11 转GmRAV基因烟草T2代功能分析
3 结果与分析
3.1 **性消减杂交(SSH)
3.1.1 大豆总RNA的提取
3.1.2 SMART技术合成cDNA
3.1.3 双链cDNA的Rsal酶切结果
3.1.4 正向差减产物的PCR扩增结果
3.1.5 反向Northern斑点杂交筛选结果
3.1.6 测序与同源性检索结果
3.1.7 候选cDNA片段差异表达检测分析结果
3.1.8 基因功能相关分析
3.2 大豆GmRAV基因克隆
3.2.1 大豆GmRAV基因5'RACE和3'RACE克隆
3.2.2 大豆GmRAV基因全长序列的生物信息学及系统进化分析
3.2.3 GmRAV全长基因组DNA序列的获得
3.3 大豆GmRAV基因表达研究
3.3.1 大豆叶片中GmRAV基因在LD和SD条件下基因表达
3.3.2 大豆GmRAV基因在LD和SD条件下组织特异性表达分析
3.3.3 激素对大豆叶片中GmRAV基因的表达影响
3.4 植物表达载体pBI121-GmRAV的构建
3.5 烟草的遗传转化
3.5.1 丛生芽和根的诱导
3.5.2 转基因烟草的PCR检测
3.5.3 转基因烟草的PCR-Southem检测
3.5.4 转基因烟草的Nortthem blot检测
3.5.5 长日照和短日照下转基因烟草的T2代表型观察
3.5.6 转GmRAV基因烟草植株矮化与BR和GA激素有关
3.5.7 过量表达GmRAV增强了ABA促进叶片衰老的效应
3.5.8 暗处理下GmRAV过量表达加速植株的衰老
4 讨论
4.1 光周期和衰老相关基因表达谱分析
4.2 光周期和衰老相关基因的克隆
4.3 植物表达载体的构建及烟草的遗传转化
4.3.1 采用农杆菌转化植物的优势
4.3.2 转化农杆菌及其鉴定
4.3.3 用于转化的农杆菌的培养
4.3.4 叶盘法转化烟草
5 结论
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
图版

本研究在细胞分子水平上从基因差异表达的角度研究短日照光周期诱导开花和衰老过程中基因转录丰度的变化，克隆与大豆光周期反应及衰老有关的基因，并对其进行转基因功能研究，通过基因的克隆和改造，试图从根本上改变大豆对光的敏感性，为大幅提高大豆单产和总产寻找到新的突破口。并且为进一步探索大豆叶片感受日长变化诱导开花和衰老的复杂机制奠定了良好的理论基础。