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《细胞工程》系统地介绍了细胞工程的基本理论与技术,内容主要包括细胞工程基础、植物细胞工程和动物细胞工程。全书共分为13章,依次为绪论(细胞工程的研究内容、发展简史和应用前景)、细胞全能性与形态发生、植物细胞工程常规技术、植物脱毒与离体无性繁殖技术、单倍体诱导和染色体加倍、植物胚胎培养、植物细胞培养与次级代谢产物生产、植物原生质体培养和细胞融合、种质离体超低温保存与人工种子、动物细胞培养、动物细胞融合与单克隆抗体、胚胎工程与动物克隆和干细胞技术。《细胞工程》内容简明,突出基础性和实用性,为了方便学习,教材每章配有知识框、小结、思考题、扩展阅读资料。
《细胞工程》适合作为高等院校生物工程、生物技术、生物科学、医药和农林类专业的本科教材及相关专业教师和科技人员的参考书。 细胞工程_周岩许君胡根海石瑛_科学出版社_

前言
第1章 绪论
1.1 细胞工程基础
1.2 细胞工程的发展史
1.3 细胞工程与其他相关学科的联系及其应用
本章小结
思考题
第2章 细胞全能性与形态发生
2.1 细胞全能性
2.2 植物细胞全能性的实现途径
2.3 植物的形态建成
2.4 植物体细胞胚胎发生
2.5 基因表达与位置效应及器官分化信息传递
本章小结
思考题
第3章 植物细胞工程常规技术
3.1 植物细胞工程所需的基本条件
3.2 植物细胞工程中的无菌技术
3.3 培养基及其配制
3.4 细胞工程的基本程序
3.5 外植体的褐变与玻璃化苗
3.6 培养基母液的配制与保存
3.7 MS固体培养基的配制与**
本章小结
思考题
第4章 植物脱毒与离体无性繁殖技术
4.1 植物脱毒与离体无性繁殖概述
4.2 植物脱毒的原理和方法
4.3 离体无性繁殖技术
4.4 马蹄莲试管苗的离体培养
4.5 马铃薯茎尖培养脱毒及脱毒苗的鉴定
本章小结
思考题
第5章 单倍体诱导和染色体加倍
5.1 单倍体培养及其意义
5.2 雄核发育机制及其影响因素
5.3 花药和花粉培养
5.4 单倍体植株的染色体加倍
5.5 花粉植株的倍性鉴定
5.6 花药(或花粉)培养白化苗问题
5.7 离体花药和花粉培养实验
本章小结
思考题
第6章 植物胚胎培养
6.1 胚胎培养的内容及意义
6.2 合子胚培养
6.3 胚胎培养的其他类型
6.4 胚胎培养案例
本章小结
思考题
第7章 植物细胞培养与次级代谢产物生产
7.1 细胞的分离与培养
7.2 细胞培养的技术关键
7.3 细胞规模化培养与次级代谢产物生产
7.4 植物细胞培养生物反应器
7.5 体细胞无性系变异与突变体筛选
7.6 细胞悬浮培养与细胞生长量计量实验
本章小结
思考题
第8章 植物原生质体培养和细胞融合
8.1 原生质体的分离与纯化
8.2 原生质体的培养
8.3 原生质体融合
8.4 向日葵原生质体的游离和融合
本章小结
思考题
第9章 种质离体超低温保存与人工种子
9.1 基本概念
9.2 种质的超低温保存
9.3 人工种子
本章小结
思考题
第10章 动物细胞培养
10.1 动物细胞培养的特点与应用
10.2 动物细胞培养技术
本章小结
思考题
第11章 动物细胞融合与单克隆抗体
11.1 动物细胞融合
11.2 单克隆抗体
本章小结
思考题
第12章 胚胎工程与动物克隆
12.1 动物胚胎发育的基本过程
12.2 体外受精
12.3 胚胎移植技术
12.4 胚胎冷冻保存技术
12.5 动物克隆技术
12.6 转基因动物
本章小结
思考题
第13章 干细胞技术
13.1 基本概念
13.2 干细胞的生物学特性
13.3 干细胞培养体系的建立
13.4 干细胞的应用
本章小结
思考题
主要参考文献

第1 章绪论
细胞工程(cell engineering
)是在细胞学的研究基础上发展起来的,其操作对象是细胞或组织,基本技术是细胞与组织培养。细胞工程与其他生物技术密切配合,为其他生物技术提供了基础和平台。在人类告别20
世纪步入21 世纪的10
多年里,生命科学发展异常迅猛,取得了一个又一个令人瞩目的成就,震惊世界,它推动着科学的进步、促进着经济的发展、影响着社会的进步,成为21
世纪发展*快的领域。在这些生命科学的伟大成就中,细胞工程所作出的贡献极为突出,如克隆动物、干细胞、生物反应器等就是细胞工程的典型结晶。细胞是生命活动的*基本单位,为基因的表达和产物的合成提供了基础和载体。基因工程中基因的表达,微生物工程中工程菌的构建,酶工程、生化工程和蛋白质工程中蛋白质的合成等都离不开细胞工程。某种意义上来说,基因工程是现代生物技术的核心,而细胞工程则是它的基础和公用平台,基因工程和细胞工程的结合决定着生物技术的发展。

1.1 细胞工程基础
1.1.1 细胞工程的概念
细胞工程 (cell engineering)
是按照一定的设计方案,通过在细胞、亚细胞或组织水平上进行实验操作,获得重构的细胞、组织、器官及个体,创造优良品种和产品的综合性生物工程。细胞工程涉及的范围很广,按生物类型可分为动物细胞工程、植物细胞工程和微生物细胞工程;按实验操作对象可分为细胞与组织培养、细胞融合、细胞核移植、染色体操作和转基因工程等。以细胞工程为基础派生出不少以工程冠名的新领域,如组织工程、胚胎工程和染色体工程等。
1.1.2 细胞工程的研究内容
1)细胞与组织培养
细胞培养(cell culture )和组织培养(tissue culture )都属于离体培养(in vitro
culture),是指细胞和组织在离体条件下的生长和增殖。细胞的离体培养称为细胞培养;组织的离体培养称为组织培养。细胞与组织培养技术是细胞工程的*基本技术,细胞融合、细胞核移植、染色体工程、转基因工程和胚胎工程等细胞工程技术都离不开细胞或组织培养,近年来兴起的组织工程和生物反应器就是在细胞与组织培养技术基础上直接发展起来的。
2)细胞融合
细胞融合(cell fusion )又称细胞杂交(cell hybridization
),是指两个或两个以上的细胞融合形成一个细胞的过程。在自然情况下发生融合的现象称为自然融合;用人工方法使细胞间发生融合的技术称为人工诱导融合。细胞融合的范围很广,不同种类之间,甚至动物与植物的细胞之间都能发生融合,细胞融合已成为研究细胞功能、遗传、免疫、**和新品种培育的重要手段。利用细胞融合技术而发展起来的单克隆抗体技术,已成功地应用到基础生命科学研究和医药生产的各个领域,极大地促进了生命科学的发展,取得了极为可观的经济效益,是应用*成功的生物技术之一。
3)细胞核移植
细胞核移植(nuclear transplantation
)是利用显微操作技术将细胞核与细胞质分离,然后再将不同来源的核与质重组,形成杂合细胞的技术。克隆动物“多莉”羊的诞生使细胞核移植技术引起了全世界的关注。
4)染色体工程
染色体工程(chromosome engineering
)是指把单个染色体或染色体组转入或移出受体细胞,从而形成新的染色体组合和遗传构成的技术。该技术可以广泛应用于优良品种的培育,如多倍体育种已经成为常规的育种技术。近年来发展起来的人工染色体技术为基因组研究、基因转导和基因**等提供了重要手段和途径。

5)胚胎工程
胚胎工程(embryo engineering
)是以生殖细胞和胚胎细胞为对象进行的细胞工程操作,主要技术包括体外受精、胚胎移植和胚胎切割等。胚胎工程在畜牧业生产上已经得到广泛的推广应用,成为常规的畜牧优良品种繁育技术。
6)干细胞与组织工程
干细胞(stem cell
)是动物体内具有分化潜能,并能自我更新的细胞,分为胚胎干细胞和组织干细胞。胚胎干细胞来自囊胚期的内细胞团,属于全能干细胞,每个细胞都可以发育成一个完整个体。组织干细胞存在于成体组织中,数量很少,属于单能或多能干细胞,可以定向分化为一种或几种不同的组织。干细胞在体外可以诱导分化为不同的组织,为临床移植和细胞**带来了希望。骨髓和皮肤干细胞早已应用到了临床。组织工程(tissue
engineering)
是在干细胞基础上发展起来的,是干细胞与材料科学相结合,将自体或异体组织的干细胞经体外扩增后种植在预先构建好的聚合物骨架上,在适宜的生长条件下干细胞沿聚合物骨架迁移、铺展、生长和分化,*终发育形成具有特定形态和功能的工程组织。目前已成功地在体外培养了人工软骨、皮肤等多种组织。
在植物中类似动物的干细胞是胚性细胞(embryogenic cell
),包括合子与早期胚胎细胞、顶端分生组织中的胚性细胞、成熟器官中**的胚性细胞等。合子、早期胚胎细胞和顶端分生组织的胚性细胞与动物的胚胎干细胞相似,可以分化形成各种组织和器官。根端分生组织的胚性细胞、成熟器官中**的胚性细胞则与动物的组织干细胞相似,只能分化为特定的组织,如根端分生组织的胚性细胞只能分化为根。
7)转基因生物与生物反应器
(1)转基因动物生物反应器。转基因动物(transgenic animal
)是通过基因工程技术将外源的目的基因导入生殖细胞或早期胚胎细胞,并整合到受体细胞的基因组中,经发育形成的所有细胞都包含有目的基因的动物个体。目的基因在器官或组织中进行特异性高表达的转基因动物称为动物生物反应器(animal
bioreactor
)。目前,研究较多的有乳腺生物反应器、血液生物反应器和膀胱生物反应器等。其中乳腺生物反应器*引人注目,已经进入产业化。

(2)转基因植物生物反应器。转基因植物(transgenic
plant)的制备比转基因动物相对简单。通过基因工程技术将外源的目的基因导入植物细胞后直接进行诱导培养就可以再生出转基因植株。当这些转基因植株开花结果时,所改变的遗传性状就可以通过种子遗传给下一代植株。转基因棉花、大豆、油菜和玉米等已经开始了大面积的种植。我国转Bt基因抗虫棉的推广已取得了巨大成功,使农药的使用量减少了70%~80%
,大幅度降低了生产成本,减少了环境污染。能够生产某些重要蛋白质和次级代谢产物的转基因植物称为植物生物反应器(plant
bioreactor)。目前,研究*多的是生产抗体和疫苗的植物生物反应器。

1.2 细胞工程的发展史
无论是动物细胞工程还是植物细胞工程,都是在细胞与组织培养的基础上发展起来的,其研究历史可追溯到19
世纪中期。从其诞生至今,大体经历了探索、奠基和迅速发展3 个主要阶段。
1.2.1 探索阶段
自1839 年Schwann 和Schleiden 建立细胞学说后,细胞学研究有了飞速的发展。Hertwig
和Strasburger 分别于1876 年和1884 年在动物和植物中观察到了受精和精卵细胞融合现象;Fleming 于1882
年在动物细胞中发现了有丝分裂;Strasburger 于1880 年发现了植物的有丝分裂。van Beneden
和Strasburger 分别于1883 年和1886
年在动物和植物细胞中发现了减数分裂。这一时期的细胞学研究,尤其是细胞分裂与增殖的发现,为细胞与组织培养技术的创立奠定了重要的实验基础。
1902 年,Haberlandt 提出了植物细胞全能学说(cell totipotency
),并开展了植物的细胞和组织培养实验,但受当时条件限制没有取得成功。经过半个世纪的不懈努力,直到1958 年,Steward
由胡萝卜韧皮部组织经诱导培养成功获得了再生植株。以组织培养为基础,花粉培养、器官培养相继获得成功,植物快繁、脱毒和大规模培养技术也实现了产业化。
动物组织培养技术*早由Harrison 于1907
年创立。当时他的主要目的是想通过神经组织的体外培养弄清神经纤维的起源问题,设计了悬滴培养法,建立了一套无菌操作技术,并在体外培养神经细胞获得成功,观察到神经纤维发生的动态过程。后来,在培养基和培养方法上做了大量改进与创新,动物细胞培养技术不断完善。以细胞培养为基础发展起来的胚胎工程、干细胞和组织工程已成为生物技术中*具活力的领域,细胞的大规模培养技术也取得了很大进展。
1.2.2 奠基阶段
尽管细胞培养是细胞工程中非常重要的技术,但也仅仅是为细胞工程的诞生奠定了基础,真正意义上的细胞工程应该是从细胞融合开始的。因为细胞融合是按照人们的设计对细胞进行工程操作,并构建新的细胞。早在19
世纪上半叶,人们就在多种生物中发现了多核现象,并推测多核细胞是由单个细胞彼此融合而形成的。然而,用实验的方法直接实现细胞的融合则是在细胞培养技术建立以后。Okata
于1962 年发现仙台病毒(Sendai
virus)可诱发艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞体,为动物细胞融合技术的创立做了奠基性工作。直到今天该方法仍然被应用。植物和微生物的原生质体融合技术是在动物细胞融合技术的基础上发展起来的,迄今为止,人们已经进行了大量的动物、植物和微生物的细胞融合实验,包括种内、种间、属间、科间,甚至动、植物间细胞的融合,培育出了许多新品种,创造了极大的经济价值。其中,单克隆抗体技术是细胞融合中*成功的典范。1975
年 Milstein 与Kohler
合作,将绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,得到了既能在体外无限繁殖又能产生特异性抗体的杂交瘤细胞,导致了免疫学技术的革命,他们二人也因此获得了诺贝尔生理学或医学奖。
1.2.3 迅速发展阶段
细胞核移植的构想*早由德国胚胎学家Spemann 于1938
年提出,认为早期胚胎细胞具有高度的分化潜力,将胚胎的细胞核移植到去核卵母细胞中可以发育为新的胚胎。1952 年,Briggs
和King 将北美洲的豹蛙囊胚的细胞核移入去核的卵母细胞中,获得了北美洲豹蛙的胚胎克隆后代,证实了Spemann 的伟大设想。1962
年,Gurden
将南非爪蟾蝌蚪期肠上皮细胞核移植到被紫外线破坏了细胞核的卵母细胞内,获得了发育正常的个体。哺乳动物的胚胎细胞核的移植实验开始于1975
年Bromball 在家兔上所做的工作,其后相继获得了小鼠、绵羊、牛、家兔、山羊和猪的胚胎细胞核克隆后代。1997
年,“多莉”羊的诞生标志着哺乳动物的体细胞核克隆时代的到来,小鼠、牛、猪、骡子等许多动物都获得了体细胞的克隆后代。
20 世纪70
年代中期,基因重组技术与细胞工程技术的结合,使细胞工程发展到了一个新的阶段,产生了转基因动物和转基因植物。1974
年,Jaenisch 和Mintz **报道向小鼠囊胚注射SV40 DNA 后,发育成的小鼠的部分组织中检测到了SV40 的DNA
序列,但是,这还不是真正意义上的转基因动物。**只转基因动物是Gordon 等通过向小鼠的单细胞胚胎的原核注射纯化的DNA
后获得转基因小鼠。1983 年,Palmiter 和Brinster
将大鼠的生长激素基因转入小鼠,生产出生长速度极快的**小鼠(硕鼠)。在此后的几年里,转基因动物的研究及以改进经济性状为目标的兔、羊、猪、牛、鸡和鱼等转基因动物陆续问世。除了转基因鱼外,多数转基因动物并没有达到预期目标。这一时期,乳腺生物反应器的研究也取得明显进展。在Gordon
于1987 年获得分泌组织纤溶酶原激活因子tPA
的转基因小鼠后的数年内,转基因羊、猪、牛的乳腺生物反应器相继研究成功,利用乳腺生物反应器生产出了多种生物**,如凝血因子IX、凝血因子XIII
、抗胰蛋白酶、tPA、红细胞生成素(EPO)等。动物克隆及干细胞技术与转基因动物技术相结合,大大加快了动物生物反应器的研究与应用进程,显示了极为诱人的前景。
1983
年,利用根癌农杆菌介导法转化烟草获得了世界上**株转基因植物。从此,转基因植物的研究取得了飞速发展,多种抗病虫、抗除草剂的转基因植物相继问世。目前,利用植物生物反应器生产的**、色素、食品添加剂、酶、农药等次生物质和活性物质已达300
多种。
细胞工程是一个非常年轻富有活力的学科。从诞生到现在还不到百年的历史,组织培养技术与其他生物技术已经一起成为世界经济中*具活力的支柱性产业,产生了巨大的经济效益和社会影响。相信随着人们对生命科学认识的不断深入,细胞工程技术会得到更快的发展,在解决困扰人类生活的人口、资源与环境等重大问题上会有更大的作为。
1.3 细胞工程与其他相关学科的联系及其应用
1.3.1 细胞工程与其他相关学科的联系
1)植物组织培养与生物学科的关系
随着现代生命科学与技术的不断进步,尤其是外源激素的应用,组织培养不仅从理论上为相关学科提供了广泛的实验证据,而且一跃成为一种大规模、批量工厂化生产种苗的新方法,并在生产上得到广泛的应用。植物组织培养既是一门相对独立的学科,同时又与其他生物学科有着密切的联系,它为植物学、植物生理学、植物遗传育种学、胚胎学、解剖学、分子生物学、细胞生物学、生物工程等学科研究植物生长发育、抗性生理、激素及器官与胚胎发生机制等提供了许多良好的试材和有效、快速的方法与途径。
2)植物组织培养学科的建立依赖于生物学科理论的发展
植物组织培养的重要理论基础是植物学、植物生理学、遗传学、发育学及微生物学等学科,在这些学科快速发展的基础上形成了植物组织培养学科。只有对生物细胞的结构、机能及发育特征等有了深入了解,才有可能对其进行控制培养;也只有对细胞遗传物质的本质有了清楚的认识,才有可能对其进行定向培养。由于植物组织培养是一个综合性的实验技术体系,每一项技术均涉及其他有关领域,它的研究和利用更需要相关技术的协作和补充。
3)植物组织培养为生物学研究提供新的实验体系
植物离体培养技术使人们可以在人工控制和模拟条件下对植物进行研究和改造,这不仅排除了自然环境中不可预测性因素的干扰,而且还可以大大缩短研究周期,加速相关学科的研究进程。组织培养在理论上是研究细胞学、遗传学、发育学、生物化学和**学等学科的重要手段。
细胞融合、核移植为人类定向改造生物遗传性状提供了有效技术途径。细胞培养使开展多细胞生物的单细胞生命活动研究成为可能,从而促进了人类对生命活动的认识。植物试管内传粉授精技术、子房培养技术、利用未成熟花药进行单倍体育种技术、细胞悬浮培养技术、看护培养技术及植物茎尖脱毒快速繁殖技术等,都极大地丰富了植物学研究的手段,拓展和加深了植物学研究的广度与深度。利用单细胞培养技术研究植物光合代谢是非常理想的方法,如在细胞生化合成研究中,通过组织培养查明了烟碱(俗称尼古丁)在烟草中的合成部位;在植物病理学中,可用单细胞或原生质体培养快速鉴定植物的抗病性、抗逆性,几天内就可获得抗性结果。
4)植物组织培养与其他生物技术相互促进
植物生物技术是按人类的意愿有目的地改良植物的一种新技术,是当前世界新技术革命的一个重要组成部分。植物遗传转化技术属于生物技术的组成部分,虽然不直接属于植物组织培养,但与组织培养紧密相关。植物组织培养既是遗传转化的基础,又是遗传转化获得种质材料并用于生产的桥梁,在基因表达及调控的研究上组织培养技术为其提供了有效方法。
1.3.2 细胞工程的应用
1)植物细胞工程的应用
植物组织和细胞培养技术具有取材少、培养材料经济、培养条件可人为控制、生长周期短、繁殖率高、管理方便和利于自动化控制等特点,因此在生产和研究中得到了广泛的应用。
离体快速繁殖和脱毒技术是目前植物组织培养中应用*多、*广泛和*有效的一个方面。植物组织培养主要应用于以下几个方面。
(1)快速繁殖技术。快速繁殖技术(rapid
propagation)也称微繁殖技术(micropropagation),是利用组织培养方法将植物体某一部分的组织小块进行培养并诱导分化成大量的小植株,从而达到快速无性繁殖目的的技术。其特点是繁殖速度快、周期短、不受季节气候等的影响,并可实现工业化生产。这一技术已有几十年的历史,现已基本成熟。新育成及新引进品种、稀缺品种、优良单株、濒危植物和基因工程植株等都可通过离体快速繁殖及时提供大量优质种苗。目前很多观赏植物、园艺作物、经济林木、无性繁殖作物等都用离体快速繁殖提供苗木。
(2)植物的去病毒技术。植物的去病毒技术也称脱毒技术(virus eradication
),是微繁殖技术的一个分支。植物病毒病严重地影响着农业生产,植物病毒的种类很多,而且可以通过维管束传导。因此,无性繁殖的植物一旦染上病毒,就会代代相传,越趋严重。常见的马铃薯、草莓等出现一年比一年小的“退化”现象就是病毒造成的。过去人们曾**过多种物理、化学及生物**的方法,但收效甚微。情况严重时,只能采取拔除并销毁病株的方法。自20
世纪50 年代初,Morel 和Martin 发现用茎尖培养方法可以从严重感染病毒的大丽花植株得到无病毒苗,以及Morel 在1960
年又利用茎尖培养获得无病毒的兰花以来,利用茎尖培养技术已在多种植物,尤其是许多园艺植物中解决了病毒危害的问题,此后,还建立了通过愈伤组织培养脱病毒等多种获得无病毒苗的方法。目前,应用组织培养脱毒技术已在无性繁殖的农作物(甘薯、甘蔗等)、果树(苹果、葡萄等)、蔬菜(马铃薯、大蒜等)和花卉(兰花、水仙等)等许多植物的常规生产上得到应用,提高了产量或恢复了原品种的优良性状。
(3)花药、花粉培养和育种。花粉是单倍体,在离体条件下培养诱导成的单倍体花粉小植株,其隐性基因可以不受显性基因的影响而表达,便于选择。经人工加倍后,就可获得纯合二倍体。1964
年,印度植物学家Guha 和Maheshwari
**对毛叶曼陀罗花药进行培养获得许多胚状体(embryoid),并证明胚状体直接起源于花粉粒,*终从胚状体进一步发育得到单倍体植株。目前,世界上至少有34
个科,88 个属,300
多种植物的花药培养成功获得完整植株。花药和花粉组织培养能缩短育种周期、简化选育程序,已成为一种在植物育种上十分有效的技术。现已育成一大批高产优质品种,并在生产中得到推广应用。
(4)原生质体培养和体细胞杂交。无壁的植物原生质体仍具有在一定条件下长成完整植株的全能性。由于原生质体的膜很薄,所以给实验操作带来不少便利。自1960
年英国科学家Cocking 用酶法去除植物细胞壁获得大量有活力的原生质体以来,
植物原生质体的分离和培养已经取得了很大进展。烟草、胡萝卜、矮牵牛、石刁柏、颠茄、芸薹、曼陀罗、石龙芮、金鱼草、马铃薯等植物已能从原生质体再生成完整的植株,但在禾谷类、豆类和纤维作物等重要经济作物上进展缓慢。原生质体的分离和培养技术为通过体细胞融合实现远缘细胞杂交奠定了基础,也为外源基因导入等遗传操作及许多细胞生物学基础研究提供了良好的材料。随着原生质体培养体系的不断完善,除成功获得一批远缘体细胞杂种外,细胞融合技术近年来已在一些重要作物的育种中得到初步应用。
(5)次级代谢产物的生产。植物中存在许多人工难以合成但具有显著**或经济价值的特殊物质。由于环境恶化和人类需求量的日益增大,许多植物资源正面临枯竭的危险。利用植物组织或细胞大规模培养来生产人类所需要植物所特有的产物,受到了世界许多**和科学工作者的极大重视,并已取得令人振奋的进展。目前,能利用植物细胞工程生产的次级代谢产物包括**、香精、食品、化工产品等许多类型,有些已投入工业化生产,预计今后还将有更大发展。
(6)植物种质资源的保存和交换。植物种质资源的保存有两大难题,一是由于环境遭受破坏,遗传资源日益枯竭,造成有益基因的丧失;二是常规田间保存耗资巨大,而且在遇到自然灾害时往往束手无策,难以达到万无一失的目的。利用离体植物组织和细胞超低温保存