《基因工程原理》共8章,系统介绍了基因工程基本原理与操作技术,主要包括科学
巨匠的贡献、常规分子技术、工具酶、表达系统、基因克隆、基因功能研究策
略、动植物基因工程、基因信息分析技术等。注重基础知识与发展前沿的结
合,紧扣基因工程发展脉络,体现了该领域的新技术、新成就与新动态。本
书引用大量科学研究案例,简明扼要,深入浅出,注重科学性、先进性、实用
性和启发性。

第1章 绪论1
1.1 基因工程的发展历程1
1.1.1 基因概念提出2
1.1.2 基因结构与功能2
1.1.3 基因操作关键技术突破4
1.1.4 基因工程问世4
1.2 基因工程大学科与大科学5
1.2.1 海量基因信息6
1.2.2 复杂基因网络7
1.2.3 基因工程系统7
1.3 基因工程研究的意义7
1.3.1 揭示生命现象规律7
1.3.2 基因工程与疾病**8
1.3.3 基因工程产业8
思考题10
第2章 基因工程基本技术原理11
2.1 核酸的提取与鉴定11
2.1.1 基因组DNA的提取11
2.1.2 RNA的提取14
2.1.3 质粒DNA的提取15
2.1.4 核酸的凝胶电泳18
2.1.5 变性梯度凝胶电泳20
2.1.6 核酸的定量与纯度的测定21
2.2 PCR技术21
2.2.1 PCR的原理22
2.2.2 PCR的操作22
2.2.3 PCR衍生技术24
2.2.4 PCR定点诱变27
2.3 核酸序列测定30
2.3.1 Sanger双脱氧链终止法31
2.3.2 Maxam-Gilbert化学修饰法32
2.3.3 Roche454测序32
2.3.4 Illumina测序33
2.3.5 ABI SOLiD测序34
2.3.6 HeliScope测序36
2.3.7 单分子测序36
2.3.8 纳米孔测序技术37
2.4 分子杂交技术37
2.4.1 Southern杂交37
2.4.2 Northern杂交39
2.4.3 Western杂交40
2.4.4 菌落原位杂交41
2.4.5 荧光原位杂交42
思考题43
第3章 基因工程工具酶44
3.1 限制性核酸内切酶44
3.1.1 限制和修饰现象44
3.1.2 限制性核酸内切酶的类型45
3.1.3 Ⅱ型限制性核酸内切酶的命名48
3.1.4 影响限制性核酸内切酶活性的因素48
3.2 DNA聚合酶50
3.2.1 大肠杆菌DNA聚合酶50
3.2.2 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow段51
3.2.3 T4DNA聚合酶51
3.2.4 T7DNA聚合酶(修饰的T7DNA聚合酶)52
3.2.5 实验室常用的耐热DNA聚合酶52
3.2.6 逆转录酶53
3.3 DNA连接酶53
3.3.1 DNA连接酶的类型53
3.3.2 DNA连接酶的特点54
3.3.3 连接反应的机制55
3.3.4 影响连接反应的因素55
3.4 核酸修饰酶57
3.4.1 末端脱氧核苷酸转移酶57
3.4.2 T4多核苷酸激酶57
3.4.3 碱性磷酸酶58
3.4.4 核酸外切酶59
3.4.5 单链DNA内切酶60
3.4.6 甲基化酶61
思考题63
第4章 基因工程载体与表达系统64
4.1 载体概述64
4.1.1 载体研究背景64
4.1.2 载体共性特征65
4.2 克隆载体类型65
4.2.1 质粒载体65
4.2.2 噬菌体载体70
4.2.3 噬菌粒载体73
4.2.4 病毒载体73
4.2.5 人工染色体克隆载体74
4.3 原核表达系统74
4.3.1 原核表达载体**表达的元件74
4.3.2 大肠杆菌表达系统77
4.4 真核生物表达系统82
4.4.1 酿酒酵母表达系统82
4.4.2 巴斯德毕赤氏酵母表达系统82
4.4.3 酵母表达系统的应用83
思考题83
第5章 目的基因分离与鉴定84
5.1 基因文库法获取目的基因84
5.1.1 基因文库的构建84
5.1.2 cDNA文库的构建86
5.1.3 筛选基因文库获得目的基因87
5.2 PCR技术分离目的基因87
5.2.1 已知基因全长序列87
5.2.2 已知基因部分序列88
5.3 图位克隆获得目的基因89
5.4 转座子标签法获得目的基因90
5.5 电子克隆91
5.6 目的基因的鉴定91
5.6.1 表型检测法92
5.6.2 核酸探针杂交法93
5.6.3 RNA筛选和序列鉴定法 94
5.6.4 物理特性检测法94
思考题95
第6章 基因功能研究技术96
6.1 常规分析技术96
6.1.1 基因沉默96
6.1.2 基因敲除104
6.2 高通量分析技术108
6.2.1 基因芯片108
6.2.2 蛋白芯片109
6.3 大分子相互作用分析技术109
6.3.1 免疫共沉淀110
6.3.2 染色质免疫沉淀技术110
6.3.3 RNA免疫沉淀法111
6.3.4 酵母双杂交111
6.3.5 光遗传114
思考题115
第7章 动植物基因工程116
7.1 转基因植物116
7.1.1 植物基因工程的常用方法116
7.1.2 转基因植物的筛选与鉴定122

7.1.3 提高外源基因在植物中表达水平的策略125
7.1.4 转基因植物的应用128
7.2 转基因动物131
7.2.1 动物基因工程的常用方法131
7.2.2 转基因动物的筛选与鉴定136
7.2.3 提高外源基因在动物中表达水平的策略137
7.2.4 转基因动物的应用139
思考题146
第8章 基因信息分析技术147
8.1 常用生物分子数据库147
8.1.1 核酸数据库147
8.1.2 蛋白质序列数据库151
8.1.3 其他常用生物分子数据库152
8.2 软件分析应用155
8.2.1 用BLAST进行局部序列比对155
8.2.2 用CLUSTAL犃犔进行多序列比对156
8.2.3 用Primer Premier进行引物设计156
8.2.4 限制性内切酶分析157
8.2.5 用JASPAR查找转录因子结合位点158
8.2.6 EMBOSS工具包158
8.2.7 其他常用生物信息学软件160
思考题160
主要参考文献162

提 要
基因是存在于DNA上的核苷酸序列,具有特定的结构、功能以及遗传特征。从基因到基 因工程的一个多世纪的研究结果,充分展示了人类从认识自然到改造自然的过程。基因工程技 术在造福于人类的同时,也给人类无限遐想的空间,基因工程的迅猛发展将人类带入实现梦幻 的年代。
基因工程(gene engineering),又称遗传工程,一般指利用分子生物学的手段,将不同生物 的遗传物质按人们的意志或需要,进行基因的定向改造、突变与重组,从而使生物体的遗传性状 发生变异。基因工程操作涉及DNA特异位点酶切、载体连接、不同DNA片段重组、转人受体 细胞、重组子筛选等系列过程。基因工程作为一门学科已被广泛地接受与认同。基因工程*显 著的特征是能够打破种属的界限,在基因水平上改变生物遗传性,并通过工程化手段为人类提 供有用的产品及服务。
1.1基因工程的发展历程
生命科学发展的历史长河中,经历了从描述生物学、实验生物学到创造生物学三个发展阶 段。描述生物学阶段可以追溯穴居的远古人类,通过观察与文字记载,积累形成对生命现象的 描述;到了 18?19世纪,人们对动物、植物和微生物做了大量的形态结构的观察、描述和分类的 工作。从19世纪中叶至20世纪中叶,由于显微镜技术的迅速发展,人们可以看到细胞和细胞 器的精细结构,可以通过设计实验来研究生命现象的规律,不再仅仅满足于生命现象的描述。 这一世纪,可以说是生物学飞速发展的百年,*重要的里程碑有两个:1944年Avery**证实 了 DNA是遗传物质;1953���Watson和Crick的DNA双螺旋模型提出,完成了对DNA功能 与结构*本质的认识,标志着实验生物学阶段达到**。人类花了近20年时间探索对DNA 分子的操作技术,终于于20世纪70年代,人们在体外实现了 DNA分子重组,意味着生物学进 人了一个可以按照人们的意志对遗传物质操作的年代,这就是创造生物学阶段。20世纪末,人 类意识到生命科学众多、重大的科学问题有望在21世纪解决,一个“1世纪是生命科学的世 纪”在人们的期盼中到来。10多年过去了,一个面临大科学时代的大学科产生了,这就是系统 生物学,它利用数理、计算机科学原理和基因工程技术,从系统、整体层面回答生命科学问题,这 种不同学科高度交叉与融合,将生命科学推到一个****的高度。?
1.1.1基因概念提出
基因(gene)是丹麦科学家Wilhelm Johannsen在1909年提 出来的。WilhelmJ0hannSen(1857?1927)是丹麦的植物学家、 植物生理学家和遗传学家。他首先提出了 phenotype(表型)和 genotype (基因型)概念。1909年,当这部书翻译成德文 {_Klemente der exakten Krblichkeitslehre )时,Johannsen 用了 “gene”一词。此时的基因仅是一个推理的概念,没有确凿实验 证据。
1.1.2基因结构与功能
在遗传学发展的早期阶段,人们意识到基因的重要性,但没 有证实基因的物质结构。19世纪60年代初,Mendel以豌豆为实 验材料表明生物的某种性状是由遗传因子负责传递的,遗传下来的不是具体的性状,而是遗传 因子即基因,从而提出了遗传的分离定律和自由组合定律。这是具有历史意义的发现,可惜在 当时并未获得认同,直到1900年,他的研究被荷兰科学家Hugo de Vries、德国科学家Carl Correns和奥地利科学家Erich von Tschermak各自再次发现。
*先从结构上赋予基因内涵的是Thomas Hunt Morgan (1866?1945),美国遗传学家、现代遗传学之父。以果蝇为实验 材料,通过遗传突变,确立了基因位于染色体上。发现位于同一 染色体上的基因之间的连锁遗传特性,将多种突变基因定位在染 色体上,制成染色体图谱,即基因的连锁图。1933年获诺贝尔生 理学或医学奖。Morgan出版书籍22部,发表科学论文370篇, 正是他的研究使果蝇成为当时主要的模式生物,时至现代,果蝇 仍然是几类主要模式生物之一。Morgan对基因研究的贡献在于 将代表特定性状的特定基因与某一条特定染色体上的特定位置 联系起来,使基因不再是抽象的符号,而是在染色体上占有一定 空间的实体,从而赋予基因以物质的内涵。中国遗传学家谈家桢 院士就读于美国加州理工学院,在Morgan实验室攻读研究生, 获博士学位,后来成为中国现代遗传学的奠基人之一。
20世纪40年代以前,遗传信息被认为存在于细胞的蛋白 中,究竟什么是遗传物质不能定论。1927年Frederick Griffith **完成细菌转化实验,证实肺炎链球菌之间可以转化,但原因 并不知道,猜测可能存在一种转化因子。肺炎病菌有两种,一种 是光滑型肺炎双球菌,有荚膜、菌落光滑且有毒,这种菌通常外包 有一层黏性发光的多糖荚膜,它是细菌致病性的必要成分,引起 肺炎;另一种是粗糙型肺炎双球菌,无荚膜、菌落粗糙且无毒。将 光滑型肺炎双球菌注入小鼠体内,使小鼠致死;将粗糙型肺炎双 球菌注入小鼠体内,小鼠存活;将光滑型肺炎双球菌加热杀死后, 再注入小鼠体内,小鼠不会死亡;但将加热杀死的光滑型肺炎双 球菌与粗糙型肺炎双球菌一起注入小鼠体内,小鼠死亡。这说明 粗糙型肺炎双球菌转变成了致死的光滑型肺炎双球菌。
在 Frederick Griffith 的研究基础上,Oswald Theodore Avery(1877?1955)找到了细菌转化的原因。Avery是*早的分 (FrederickGriffith,1879?1941) 子生物学家之一、免疫化学先驱。1944年,Avery等在犑ournaS
o f Experimental Medicine发表了“脱氧核糖型的核酸是[型肺 炎球菌转化要素的基本单位”即DNA是细菌的转化因子,** 次证明了 DNA是遗传物质。从加热杀死的光滑型肺炎双球菌 中提取DNA,与粗糙型肺炎双球菌混合后,再注入小鼠体内,小 鼠死掉。Avery的实验说明带有有毒性的和能使荚膜形成的信 息分子DNA整合进了无毒菌种的染色体里,使它转化成了有毒 的菌种。从一个供体菌得到DNA,通过一定的途径,授予另一个 细菌,从而使后者的遗传特性发生改变,Avery的进一步实验证 明了这种转化因子就是DNA。
1953年Watson和Crick在Mature发表了 DNA分子结构 模型,从结构上解释了 DNA作为遗传物质的遗传信息传递机 制。James Dewey Watson(1928?),美国分子生物学家,与 Crick 一同利用X射线衍射的数据,建构了 DNA模型。1962年,
Watson与Crick、Wilkins因为对DNA结构的研究而 共同获得诺贝尔生理学或医学奖。1965年出版了划 时代的教科书《基因的分子生物学》(Molecular Biology of the Gene) ,1968 年出版《双螺旋》(Double Hlxr),同年开始兼任位于纽约长岛的冷泉港实验室 (Cold Spring Harbor Laboratory)的总管,并将研究方 向转移到癌症。
Francis Harry Compton Crick(1916?2004)是英 国生物学家、物理学家及神经科学家。Crick*重要 的成就是1953年在剑桥大学卡文迪许实验室与 Watson共同发现了脱氧核糖核酸(DNA)的双螺旋结 构。此外,他提出了众所周知的“**法则”(central dogma)概念,认为在细胞中的遗传信息的流动基本上 是单向的,即从DNA、RNA到蛋白质,尽管随后的研 究表明RNA也可逆向到DNA,但“**法则”的提出 对生命科学研究起到了推动作用。1961年Crick又 提出了三联体遗传密码,这样将DNA分子的结构与 生物学功能有机地统一起来,也为揭示基因的本质奠 定了分子基础。他*后的研究集中在神经生物学,试 图探索人类的意识。2004年因大肠癌病逝于美国加 州大学**亚哥分校,临死前还在修改研究论文,将 终身献给了科学事业。
到1959年,关于对DNA的几个重要的认识已经 完成,如DNA作为遗传物质的证实,DNA双螺旋结 构的提出,DNA半保留复制机制。但DNA如何指令蛋白质的表达,RNA在此过程有什么作 用还不知道。Nirenberg和他的学生Matthaei建立和完善了大肠杆菌的无细胞翻译体系,回答 了这些问题,完成了遗传密码的破译。
Marshall Warren Nirenberg(1927?2010)是一位犹太裔美国生物化学家与遗传学家。他 们合成了一条完全由尿嘧啶核苷酸组成的RNA,将此放入来自大肠杆菌制备的无细胞体系,再 加入20种氨基酸,其中一种是放射性标记的,在不同的实验中依次改变标记的氨基酸,结果发 现合成的带有放射性标记的蛋白质为苯丙氨酸所组成,因此知道了 RNA中UUU可以编码出 的氨基酸为苯丙氨酸,**破译了遗传密码。1961年8月,国际生物化学大会在莫斯科举行,
Crick说服了大会主持人,邀请Nirenberg报告他们的研究, Nirenberg的报告震惊了科学界。Nirenberg很快便受到科学界 极大关注,在接下来的几年,他们分别破译了赖氨酸密码 (AAA)、脯氨酸密码(CCC)。从1961年到1962年的两年,被称 为“译码竞赛,,年代,Nirenberg 在(National Institutes of Health, NIH)工作,面临纽约大学医学院、诺贝尔奖得主Severo Ochoa 大型团队的竞争。因遗传密码的破译,Nirenberg与Har Gobind Khorana和Robert W. Holley共同获得1968年诺贝尔生理学 或医学奖。Nirenberg后来聚焦于神经科学、神经发育的研究, 2010年因癌症去世。
较早阐明基因结构、功能及调控的是Francois Jacob,他是一 位犹太裔法国生物学家,他与Jacques Monod通过不同的大肠杆 菌乳糖代谢突变体来研究基因的作用,发现了乳糖利用过程中基 因的调控角色,即乳糖操纵子。细菌和其他细胞可以通过调节关 键代谢酶的水平,或这些酶的活性,以适应或应对外部条件。例 如,如果细菌在含有乳糖而不含葡萄糖的培养基中,它必须适应 性地做出调整,吸收乳糖,并能将乳糖切割成为葡萄糖和半乳糖, 再将半乳糖转换成葡萄糖。执行这些步骤需要酶来完成,当所形 成的产物足够时,酶的结构构象发生改变,停止酶的产生,起到开 关的作用。1961年,Jacob和Monod认为细胞中酶的表达可能 存在反馈**,以使酶的表达不至于过量。他们发现有种阻遏物 (repressor)能直接与DNA结合,从而控制该基因的表达。在有 乳糖存在条件下,阻遏物与乳糖结合,而再也不能与DNA结合, 转录**解除。用这种方式,构建一个反馈环路,允许消化乳糖 的蛋白质进行生产。由于发现乳糖操纵子调节机制,Jacob和 Monod与Andrd Lwoff共同获得了 1965年的诺贝尔生理学或 医学奖。
1.1.3基因操作关键技术突破
1968年,H. O. Smith等分离到一种酶,能够打断DNA分 子,而且总是在GTTAAC序列中切开双链DNA,表明此种酶具有酶切位点识别的专一性, 也称为限制性,这就为剪断DNA分子提供了“手术刀”。由于这种酶是从流感嗜血杆菌 {Haemophilus in/狌狀2:犲)分离得到的,所以称为犎狀dII,这是**个分离到的限制性核酸内 切酶。一个基因执行功能需要转录成RNA,翻译成蛋白质。在原核生物中,DNA转录出可 以直接翻译成蛋白质的RNA,但真核生物由于内含子的存在,RNA需要剪接加工,才能成为 成熟的RNA。RNA不稳定,很容易被降解,要研究一个真核生物基因功能非常困难。1963 年,Baltimore发现肉瘤病毒RNA能够逆转录成DNA,给了分子生物学家新的启迪,分离真 核生物RNA逆转录成DNA,就可以用限制酶进行选择性切割,