**篇 生物学和生物化学
**章 生物大分子的结构与功能
本章考点分析:
掌握★★★
1.蛋白质
2.核酸的分子组成与结构
3.DNA双螺旋结构模型
4.维持双螺旋结构稳定的主要因素
5.酶的分子组成
6.活性**
7.酶促反应特点
8.酶的调节
熟悉★★
1.氨基酸
2.蛋白质的理化性质
3.常用分离、纯化技术的基本原理
4.核酸的理化性质和各类RNA的结构特点
5.酶促反应动力学的影响因素
了解★
1.蛋白质分子结构与功能的关系
2.蛋白质的分类
3.酶促反应机制
**节 蛋白质的结构与功能
一、蛋白质的分子组成
1.氨基酸
(1)氨基酸分类
人体内所有蛋白质都是氨基酸组成的多聚体,且均L-α-氨基酸(除甘氨酸外)。20种氨基酸根据其侧链的理化性质可以分为五类:①非极性脂肪族氨基酸;②极性中性氨基酸;③芳香族氨基酸;④酸性氨基酸;⑤碱性氨基酸。
(2)氨基酸的理化性质
①两性解离及等电点:氨基酸是两性解离的电解质,具有两性解离的特性。氨基酸的解离方式取决于其所处溶液的酸碱度。在某一PH的溶液中,氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等,成为兼性离子,呈电中性,此时溶液的PH称为该氨基酸的等电点(PI)。
②紫外吸收性质:根据氨基酸的吸收光谱,含有共轭双键的色氨酸、酪氨酸的*大吸收峰在280nm波长附近。由于大多数蛋白质含有酪氨酸和色氨酸残基,所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值,可分析溶液中蛋白质含量。
③茚三酮反应:氨基酸与茚三酮水合物共热时,可生成紫蓝色的化合物,此化合物*大吸收峰在570nm波长处。由于此吸收峰值的大小与氨基酸释放出的氨量成正比,因此可作为氨基酸的定量分析方法。
2.肽
蛋白质中的氨基酸通过肽键连接而形成肽,连接两个氨基酸的键称为肽键。由两个氨基酸组成的*简单的肽,称为二肽;由10个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽;更多的氨基酸相连而成的肽称为多肽。肽链中的氨基酸分子因脱水缩合而基团不全,被称为氨基酸残基。
二、蛋白质的分子结构
1.蛋白质的一级结构
氨基酸的排列顺序决定蛋白质的一级结构,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。在蛋白质分子中,从N-端至C-端的氨基酸排列顺序称为蛋白质的一级结构。一级结构的主要化学键是肽键,形成肽键的6个原子处于同一平面,构成了所谓的肽单元。此外,蛋白质分子中所有二硫键的位置也属于一级结构的范畴。
2.蛋白质的二级结构
蛋白质的二级结构是指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构,也就是该段肽链主链骨架原子的相对空间位置,并不涉及氨基酸残基侧链的构象。所谓肽链骨架原子即N(氨基酸)、Cα(α-碳原子)和CO(羟基碳)3原子依次重复排列。蛋白质的二级结构主要包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲。
(1)α-螺旋
α-螺旋的每个肽腱的N-H和第四个肽键的羰基氧形成氢键,氢键的方向与螺旋长轴基本平衡。肽腱中的全部肽腱都可以形成氢键,以稳固α-螺旋结构。在蛋白质表面存在的α-螺旋,常具有两性特点,使之能在极性或非极性环境中存在。毛发的角蛋白、肌肉的肌球蛋白以及血凝块中的纤维蛋白,它们的多肽链几乎全长都卷曲成α-螺旋。
(2)β-折叠
β-折叠与α-螺旋的形状截然不同,呈折纸状。其通过肽链间的肽键羟基氧和亚氨基氢形成氢键,从而稳固β-折叠结构。蚕丝蛋白几乎都是β-折叠结构,许多蛋白质既有α-螺旋又有β-折叠结构。
(3)β-转角和无规卷曲
β-转角常发生在肽链进行180°回折时的转角上。β-转角通常由4个氨基酸残基组成,其**个残基的羰基氧(O)与第四个残基的氨基氢(H)可形成氢键。β-转角的结构比较特殊,其第二个残基常为脯氨酸。
无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。
(4)模体
在许多蛋白质分子中,可发现两个或两个以上具有二级结构的肽段,在空间上相互接近,形成一个有规则的二级结构组合,被称为超二级结构。模体是具有特殊功能的超二级结构,它是由两个或三个具有二级结构的肽段,在空间上相互接近,形成一个特殊的空间构象。锌指结构是近年来发现的一个常见的模体例子。
3.蛋白质的三级结构
(1)三级结构
蛋白质的三级结构是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置,也就是整条肽链所有原子在三维空间的排布位置。三级结构的稳定主要靠次级键,如氢键、疏水键、盐键、和Van der Waals力等。
(2)结构域
分子量较大的蛋白质常可折叠成多个结构较为紧密的区域,并各行其功能,称为结构域。结构域也可以看作是球状蛋白质的独立折叠单位,有较为独立的三维结构。
(3)分子伴侣
除一级结构为蛋白质的决定因素外,蛋白质空间构象的正确形成还需要一类称为分子伴侣的蛋白质参与。许多分子伴侣是ATP酶,目前参与蛋白质折叠的分子伴侣可以分为3类:①热休克蛋白70(Hsp70);②伴侣蛋白;③核质蛋白。
4.蛋白质的四级结构
在体内有许多蛋白质需含有2条或者2条以上多肽链,才能全面地执行功能。每条多肽链有其完整的三级结构,称为亚基,亚基与亚基之间呈现特定的三维空间排布,并以非共价键相连接,此种蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用,称为蛋白质的四级结构。含有四级结构的蛋白质,单独的亚基一般没有生物学功能,只有完整的四级结构寡聚体才有生物学功能。在四级结构中,各亚基间的结合力主要是氢键和离子键。
三、蛋白质的理化性质
蛋白质既然是由氨基酸组成的,其理化性质必然有与氨基酸相同或相关的方面,比如,两性电离、等电点、紫外吸收性质、成色反应等;但蛋白质又是大分子,具有氨基酸没有的理化性质。
1.蛋白质的两性电离性质
当蛋白质溶液处于某一PH时,蛋白质解离成正、负离子的趋势相等,即成为兼性离子,净电荷为零,此时溶液的PH称为蛋白质的等电点(PI)。蛋白质溶液的PH大于等电点时,该蛋白质颗粒带负电荷,反之带正电荷。
2.蛋白质的胶体性质
蛋白质是生物大分子之一,其分子直径可达1~100nm,为胶粒范围之内。蛋白质颗粒表面形成一层水化膜,可阻断蛋白质颗粒的相互聚集,防止溶液中蛋白质的沉淀析出。此外,蛋白质胶粒表面可带电荷,也可起胶粒稳定的作用。若去除蛋白质胶体颗粒表面电荷和水化膜两个稳定因素,蛋白质极易从溶液中析出。
3.蛋白质的变性、沉淀、复性和凝固
(1)变性
蛋白质在某些物理和化学因素作用下,其特定的空间构象被破坏,即有序的空间结构变成无序的空间结构,从而导致其理化性质的改变和生物学活性的丧失,称为蛋白质的变性。一般认为,蛋白质的变性主要发生在二硫键和非共价键的破坏,不涉及一级结构中氨基酸序列的改变。蛋白质变性后,其理化性质及生物学活性发生改变,如溶解度降低,粘度增加,结晶能力消失,生物活性丧失,易被蛋白酶水解等。
(2)沉淀
蛋白质变性后,疏水侧链暴露在外,肽链融汇相互缠绕聚集,继而从溶液中析出,这一现象称为蛋白质的沉淀。变性不等于沉淀,变性的蛋白质易于沉淀,有时蛋白质发生沉淀,但并不变性。
(3)复性
若蛋白质变性程度较轻,去除变性因素后,有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能,称为复性。但是,许多蛋白质变性后,其空间构象严重被破坏,不能复原,称为不可逆变性。
(4)凝固
蛋白质在强酸、强碱的作用下发生变性后,仍能溶解于强酸或强碱溶液中,若将pH调至等电点,则变性的蛋白质立即结成絮状的不溶解物,此絮状物仍可溶解于强酸和强碱中。如再加热,则絮状物可变成比较坚固的凝块,此凝块不易再溶解于强酸和强碱中,这种现象称为蛋白质的凝固作用。实际上,凝固是蛋白质变性后进一步发展的不可逆的结果。
4.蛋白质的紫外吸收特性
在蛋白质分子中含有带有共轭双键的酪氨酸和色氨酸,因此在280nm波长处有特征性的吸收峰。在此波长范围内,蛋白质的A280与其浓度呈正比,可作为蛋白质的定量测定。
5.蛋白质的呈色反应
(1)茚三酮反应
蛋白质水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。
(2)双缩脲反应
蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热,呈现紫色或红色,称为双缩脲反应。氨基酸不出现此反应。此反应可用来检测蛋白质的水解程度。
四、蛋白质的分离、纯化
蛋白质的分离通常就是利用其特殊的理化性能,采用透析、盐析、电泳、层析及超速离心等不损伤蛋白质空间构象的物理方法,以满足研究蛋白质结构与功能的需要。
1.透析及超滤法
利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法叫透析。应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜,达到浓缩蛋白质溶液的目的,称为超滤法,此法为蛋白质溶液浓缩常用的方法。
2.丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀
(1)丙酮沉淀
为常用的使蛋白质从溶液中沉淀的方法。蛋白质被丙酮沉淀后应立即分离,否则会变性。除了用丙酮沉淀外,还可以用乙醇沉淀。
(2)盐析
将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液,使蛋白质表面电荷被中和且水化膜被破坏,导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀的方法称为盐析。
(3)免疫沉淀
蛋白质具有抗原性,将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白,并形成抗原抗体复合物的性质,可从蛋白质混合液中分离获得抗原蛋白,即免疫沉淀法。
3.电泳
蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带点颗粒,在电场中可向正极或负极移动,这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳。根据支撑物的不同,有薄膜电泳、凝胶电泳等。在薄膜电泳中,带电多、分子量小的蛋白质泳动速度快;反之,带电少、分子量大的蛋白质泳动速度慢。
4.层析
层析是蛋白质分离纯化的主要方法之一,层析的种类很多,包括离子交换层析、凝胶过滤和亲和层析等。其中离子交换层析和凝胶过滤应用*为广泛。
(1)离子交换层析
蛋白质是两性电解质,在某一特定pH时,各蛋白质的电荷量及性质不同,故可通过离子交换层析得以分离。
将阴离子交换树脂颗粒填充在层析管内,由于阴离子交换树脂上带正电荷,能吸引溶液中的阴离子。然后再用含阴离子的溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗下来,增加阴离子浓度,含负电量多的蛋白质也被洗脱下来,于是两种蛋白质被分开。
(2)凝胶过滤
凝胶过滤又称分子筛层析,层析柱内填满带有小孔的颗粒,蛋白质溶液加于柱之顶部,任其往下渗漏,小分子蛋白质进入孔内,大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出,因此不同大小的蛋白质得以分离。
5.超速离心
超速离心法既可以用来分离纯化蛋白质又可以用来测定蛋白质的分子量。不同蛋白质的密度与形态各不相同,因而可以用此方法将其分开。 ……